案例1??ChinaMAP 分析 10,588 個人的高深度全基因組序列[1]

研究材料：10588個中國人，隨機(jī)選擇于中國27個省份的8個民族(漢族、回族、滿族、苗族、蒙古族、彝族、藏族和壯族)?。平均基線年齡為54歲，女性為64.8%。

分析內(nèi)容：構(gòu)建高質(zhì)量的中國人群遺傳變異數(shù)據(jù)、中國人群體結(jié)構(gòu)分析、基因組特征比較以及變異頻譜和致病性變異解析。該研究也通過全基因組關(guān)聯(lián)分析探索了中國人群中2型糖尿病和肥胖遺傳相關(guān)因素。在血糖相關(guān)分析中，結(jié)果驗證了部分已知的2型糖尿病風(fēng)險高頻基因位點，包括CDKAL1、SLC30A8、SND1-PAX4、IDE-KIF11-HHEX、CDKN2A-CDKN2B、KCNQ1?等，也鑒定和發(fā)現(xiàn)了DENND5B、ORM1?、MAFA、PAX6、SOX4?等新位點。

重要研究成果：

圖1 ChinaMAP基因變異的分布和模式

圖2 體重指數(shù)與血糖的關(guān)聯(lián)分析

ChinaMAP研究也通過全基因組關(guān)聯(lián)分析探索了中國人群中2型糖尿病和肥胖遺傳相關(guān)因素。在體重指數(shù)BMI相關(guān)分析中，研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)了新的東亞人群特異性CADM2基因位點，CADM2在動物研究中已證實參與調(diào)節(jié)體重和能量穩(wěn)態(tài)。而FTO等基因在歐美人群中發(fā)現(xiàn)的重要肥胖相關(guān)基因位點，在ChinaMAP研究結(jié)果中并不顯著。從這些發(fā)現(xiàn)可以提示我們，對大規(guī)模中國人群特異性的基因組學(xué)的研究，對分子機(jī)制和個體化診治的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)體系建立很重要。

案例2?NBT：主流高通量測序儀在人/細(xì)菌/宏基因組測序評測結(jié)果發(fā)布[2]

由生物分子資源設(shè)施協(xié)會（Association of Biomolecular Resource Facilities, ARBF）主導(dǎo)的ABRF NGS II期研究成果發(fā)表于Nature Biotechnology，文章題為“Performance assessment of DNA sequencing platforms in the ABRF Next-Generation Sequencing Study”。研究團(tuán)隊基于來自Illumina、Pacific Biosciences、Thermo Fisher Scientific、BGI、Oxford Nanopore Technologies和Genapsys的多款測序平臺，在多個實驗室對同一人類基因組家族、三個單獨菌株和十種細(xì)菌的宏基因組混合物進(jìn)行測序，并將各平臺數(shù)據(jù)進(jìn)行全方位、系統(tǒng)性比較，分析各個測序平臺的性能差異和測序質(zhì)量，以提供真實全面的參考證據(jù)。

數(shù)據(jù)顯示，在短讀長測序平臺中，DNBSEQ平臺提供了非常低的測序錯誤率。且SNP/Indel檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度表現(xiàn)也非常優(yōu)秀。

案例3?DNBSEQ基因組測序揭示肺鱗癌的潛在治療靶標(biāo)^[3]

Genomic sequencing and editing revealed the GRM8 signaling pathway as potential therapeutic targets of squamous cell lung cancer

肺腺癌和肺鱗癌（LUSC）是肺癌的主要病理類型，肺鱗癌占原發(fā)性肺癌的40%～51%。目前已經(jīng)有多種靶向藥物應(yīng)用于肺腺癌，但是肺鱗癌的治療靶點尚沒有突破性進(jìn)展。文章通過外顯子重測序（WES），人全基因組重測序（WGS）、靶區(qū)域捕獲測序（TS）和CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)，利用鱗狀細(xì)胞肺癌手術(shù)腫瘤和對應(yīng)的源自患者的異種移植瘤（PDX）樣本探索和驗證肺鱗癌的潛在治療靶標(biāo)。

文章亮點：

• Illumina HiSeq X Ten平臺WES測序+ DNBSEQ平臺WGS測序+ DNBSEQ平臺TS測序，多平臺數(shù)據(jù)聯(lián)合分析
• LUSC PDX模型可廣泛應(yīng)用于潛在治療目標(biāo)和策略的驗證
• 使用CRISPR系統(tǒng)對PDX腫瘤細(xì)胞中的驅(qū)動基因進(jìn)行功能驗證

通過基因組測序和CRISPR-Cas9基因組編輯的綜合分析，在手術(shù)和PDX腫瘤上整合鑒定并驗證了GRM8對LUSC腫瘤的促進(jìn)功能。cAMP活化劑和MEK抑制劑可顯著阻斷具有GRM8突變的LUSC腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。因此，GRM8信號傳導(dǎo)通路的組成分子可能成為攜帶GRM8激活突變的鱗狀細(xì)胞肺癌的治療靶標(biāo)。

?

案例4?BGISEQ-500和HiSeq X Ten全基因組測序鑒定生殖細(xì)胞和體細(xì)胞變異^[4]

Germline and somatic variant identification using BGISEQ-500 and HiSeq X Ten whole genome sequencing

該研究使用BGISEQ-500平臺對三種惡性胸膜間皮瘤及其對照的正常樣本進(jìn)行全基因組測序，并與Illumina HiSeq X Ten平臺測序結(jié)果進(jìn)行評估。兩平臺數(shù)據(jù)均使用相同的分析流程，分別比較生殖細(xì)胞和體細(xì)胞單核苷酸變異（SNP）、小插入或缺失（InDel）。結(jié)果表明BGISEQ-500平臺通過全基因組測序來鑒定腫瘤樣本的體細(xì)胞和生殖細(xì)胞突變是有潛力的可適用性的平臺，這也是該平臺首次公開可用的癌癥基因組數(shù)據(jù)。

研究結(jié)果：

• 生殖細(xì)胞突變：? ? ?
  

結(jié)果顯示，BGISEQ-500平臺和HiSeq X Ten平臺識別SNP的能力與SNP分型芯片（Infinium Omni2.5–8, Illumina ）是高度一致的（> 99％）。在兩個測序平臺中鑒定的生殖細(xì)胞SNV和indels也是高度一致（分別為86％和81.5％）。

表??SNP芯片數(shù)據(jù)分別與BGISEQ-500和HiSeq X Ten數(shù)據(jù)比較，生殖細(xì)胞突變基因型一致性的百分比

• 體細(xì)胞突變：
  

? ??????三名患者中總共10,890個體細(xì)胞SNV，大部分體細(xì)胞SNV（72％）在兩個平臺中被識別，小部分為BGISEQ-500和HiSeq X Ten兩平臺特有的（分別為14%，14%）。

圖? 利用BGISEQ-500和HiSeq X Ten的數(shù)據(jù)鑒定3個胸膜間皮瘤的體細(xì)胞突變

案例5?基于DNB的測序平臺可有效避免index hopping[5]

Reliable Multiplex Sequencing with Rare Index Mis-Assignment on DNB-Based NGS Platform

本研究使用三種主要的文庫制備方法研究了DNB測序平臺的Index hopping問題。DNBSEQ測序儀利用獨特的DNA納米球（DNB）技術(shù)，基于滾環(huán)復(fù)制（RCR）進(jìn)行文庫擴(kuò)增，這種線性擴(kuò)增可以避免常規(guī)PCR帶來的錯誤累積。基于DNB的NGS應(yīng)用僅使用單個index就實現(xiàn)了前所未有的0.0001％至0.0004％低樣本錯誤分配率。此外，用水代替DNA，加入index，增加空白對照，DNB測序平臺發(fā)生錯誤匹配的概率為36 million reads分之一，即0.0000028％。

圖? 不同測序技術(shù)的index hopping比例

研究結(jié)果：

• DNA納米球技術(shù)的高index保真度
  

? ? ? ? DNBSEQ平臺將DNB加載到規(guī)則陣列（patterned arrays）上，并利用組合引物錨定測序技術(shù)（cPAS）進(jìn)行測序。 獨特的DNB技術(shù)采用具有強鏈置換活性的Phi29聚合酶和能夠進(jìn)行線性擴(kuò)增的RCR工藝，每個擴(kuò)增循環(huán)都以原始的單鏈環(huán)狀DNA文庫為模板，保持每個拷貝子的獨立性（圖1a）。因此，即使出現(xiàn)寡核苷酸的index hopping等錯誤，也不會累積錯誤拷貝，正確的序列總是會在后面的DNA拷貝中復(fù)制，保證高的擴(kuò)增保真度。

圖??Index hopping在不同的測序平臺產(chǎn)生的機(jī)制

• PCR-free文庫index hopping污染率極低

? ??????除了常規(guī)PCR文庫外，文中還對PCR-free文庫在DNBSEQ平臺的index hopping情況進(jìn)行調(diào)查，未經(jīng)過任何Q30過濾的99.9998％精度再次證實了DNB可以在很大程度上降低index污染。與上面的常規(guī)PCR文庫類似，污染率平均約為0.0004%。

表? PCR-free 文庫index污染比率

研究意義：

1、? 高的檢測準(zhǔn)確度，保證體細(xì)胞低頻突變、HPV檢測等基因檢測的準(zhǔn)確性；

2、? Single index避免了繁瑣的non-combinatorial dual index帶來的額外成本和勞動力浪費；

3、? 避免大通量測序中樣本數(shù)據(jù)完整性的丟失。

參考文獻(xiàn)

[1]? ? Cao Y, Li L, Xu M, et al. The ChinaMAP analytics of deep whole genome sequences in 10,588 individuals[J]. Cell research, 2020, 30(9): 717-731.

[2]? ? Foox, J., Tighe, S.W., Nicolet, C.M. et al. Performance assessment of DNA sequencing platforms in the ABRF Next-Generation Sequencing Study. Nat Biotechnol 39, 1129–1140 （2021）.

[1]? ??Genomic sequencing and editing revealed the GRM8 signaling pathway as potential therapeutic targets of squamous cell lung cancer.[J]. Cancer letters, 2018.

[2]? ???Patch A M, Nones K, Kazakoff S H, et al. Germline and somatic variant identification using BGISEQ-500 and HiSeq X Ten whole genome sequencing.[J]. Plos One, 2018, 13(1):e0190264.

[3]?? ? Li Q, Zhao X, Zhang W, et al. Reliable Multiplex Sequencing with Rare Index Mis-Assignment on DNB-Based NGS Platform. bioRxiv, 2018: 343137

數(shù)據(jù)展示

標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)展示

        測試樣本選用了“瓶中基因組（Genome in a Bottle）”的人類樣本NA12878，這是目前被世界上認(rèn)為研究最透徹的二倍體人類基因組，并發(fā)布了高置信變異集，可作為一個重要工具來了解測序儀和檢測結(jié)果的表現(xiàn)。

1）有效深度30X數(shù)據(jù)展示

• 高測序數(shù)據(jù)質(zhì)量

        測試數(shù)據(jù)有至少96%的堿基識別準(zhǔn)確率高達(dá)99%，至少89%的堿基識別準(zhǔn)確率高達(dá)99.9%。

表1 測序質(zhì)量 

        測序質(zhì)量值可衡量堿基未正確檢出的概率。測序技術(shù)，一種類phred算法[1,2]會為片段中的每個堿基分配一個質(zhì)量分值，與最初因桑格測序?qū)嶒灦_發(fā)的算法類似。

        一個給定堿基的測序質(zhì)量分值Q定義為下面的等式：

         Q = -10log10(e)

        其中，e為預(yù)計堿基檢出不正確的概率。

        ? Q分值較高表示出錯的概率較小。

        ? Q分值較低可能會導(dǎo)致相當(dāng)大一部分的片段不可用，還可能導(dǎo)致假陽性的變異檢出增加，以致得出不準(zhǔn)確的結(jié)論。

        如下所示，質(zhì)量分值20表示錯誤率為1/100，相應(yīng)的檢出精確度為99%。

表2 標(biāo)測序質(zhì)量分值與堿基檢出精確度的關(guān)系

• 高比對率和覆蓋度

        應(yīng)用人的標(biāo)準(zhǔn)品 NA12878，分別在 DNBSEQ 和 N平臺分別測了 100Gb Raw data 數(shù)據(jù)。從下表可以看出，由于 N平臺 Duplicate rate 較高，需多測一定比例的數(shù)據(jù)，才有和 DNBSEQ 平臺相當(dāng)?shù)挠行疃取?

表3 DNBSEQ 與 N平臺比對數(shù)據(jù)比較

Clean bases：過濾掉接頭，低質(zhì)量和含N的reads后剩下的堿基數(shù)量；

Mapping rate：堿基比對率，比對到參考基因組的堿基數(shù)目除以clean data的堿基數(shù)目，如果測序樣本存在污染或者與參考基因組差異較大，比對率偏低會影響后續(xù)的信息分析；

Unique rate：比對到基因組上唯一位置的base比率，一條reads在相同數(shù)量的容錯時會有兩個或者兩個以上的位點都吻合，那么，它的比對結(jié)果不唯一。對于某些下游分析，需要去除比對多個位點的reads，只保留唯一比對的reads；

Duplicate reads：重復(fù)的 reads 所占比例，為了保證后續(xù)變異分析的準(zhǔn)確性，會去掉duplicate reads后進(jìn)行下游信息分析，相同數(shù)據(jù)量重復(fù)率越低，后續(xù)可用的數(shù)據(jù)量越多；

Mismatch rate：堿基的錯配率；

Average sequencing depth：有效平均深度（不計算duplication），比對到參考基因組的堿基數(shù)目除以基因組的大小；目前行業(yè)對外承諾的30X（90G）、40X（120G）等深度只是測序量的簡單換算，并不是指有效深度。

Coverage at least 1X（4X、10X、20X）：覆蓋率，指測序深度達(dá)到1X、4X、10X、20X以上的全基因組占比。

• 高靈敏度和精準(zhǔn)度

        高靈敏度（Sensitivity）和高精準(zhǔn)度（Precision）意味著 DNBSEQ 平臺檢測發(fā)現(xiàn)變異的能力更強，并且結(jié)果中為真的突變的概率也高。

表4 DNBSEQ 與 N平臺 SNP 精準(zhǔn)度和敏感度對比

表5  DNBSEQ 與 N平臺 InDel 精準(zhǔn)度和敏感度對比

Sensitivity：靈敏度，又叫真陽性率（TPR），計算公式：靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）。是指實際為陽性的樣本中，判斷為陽性的比例。例如，真正突變中，被判斷為有突變的比例，它反映篩檢發(fā)現(xiàn)變異的能力，靈敏度越高，假陰性越低；

Precision：精準(zhǔn)度，也叫陽性預(yù)測值（PPV），計算公式：精準(zhǔn)度=真陽性/（真陽性+假陽性），指篩檢試驗檢出的全部陽性變異中，真正“變異”的例數(shù)（真陽性）所占的比例，反映篩檢變異結(jié)果陽性中為真的突變的可能性，精準(zhǔn)度越高，假陽性越低。

        *上述分析結(jié)果由華大信息分析流程所得，本結(jié)果不代表交付指標(biāo)，最終解釋權(quán)歸深圳華大基因股份有限公司所有。

參考文獻(xiàn)

[1] Li Q, Zhao X, Zhang W, et al. Reliable Multiplex Sequencing with Rare Index Mis-Assignment on DNB-Based NGS Platform. bioRxiv, 2018: 343137

[2] Illumina. Effects of Index Misassignment on Multiplexing and Downstream Analysis (white paper). 4 (2017). doi:10.1101/125724 ?

表1 DNA樣本送樣建議

注意事項：

1) 務(wù)必附上凝膠電泳、NanoDropTM、Qubit?、Agilent Bioanalyzer等其中至少一種的檢測結(jié)果，電泳圖需標(biāo)明所用marker的條帶大小。

2) 樣品質(zhì)量以BGI的質(zhì)檢結(jié)論為準(zhǔn)，望合作伙伴理解，檢測結(jié)果可能會由于檢測地點，儀器設(shè)備和操作者等不同造成固有差異。因質(zhì)檢有一定的消耗量，合作伙伴寄送的樣本量必須高于各產(chǎn)品樣品標(biāo)準(zhǔn)至少50ng以上。強烈建議根據(jù)2倍以上標(biāo)準(zhǔn)制備樣品，否則很可能會導(dǎo)致大量樣本質(zhì)檢未能達(dá)標(biāo)，延誤項目進(jìn)展。

3) BGI原則上只接收1.5mL/2.0mL EP管，要求每管樣品體積在15-100μL之間（推薦30μL），根據(jù)實驗要求，如果樣品體積小于15μL，BGI可能會在檢測之前稀釋原始樣品。

表2 組織樣本送樣建議

注意事項：

1) 2 mL 螺紋旋蓋保存管

2) 組織樣品保存方法選擇:首選液氮速凍;沒有液氮條件的，可直接放入-80°C冰箱凍存; 環(huán)境條件限制的，可使用商業(yè)核酸保護(hù)液保存，并嚴(yán)格按相應(yīng)試劑說明操作。

3) 長年保存的組織:保存時間超過一年的組織不建議送樣。 

Q1：DNBSEQ 人全基因組重測序的數(shù)據(jù)格式是否與 Illumina 平臺的一致？

           是一致的。所以信息分析流程都一樣。

Q2：想對我們 DNBSEQ 產(chǎn)出的數(shù)據(jù)先分析確定一下格式和數(shù)據(jù)質(zhì)量，現(xiàn)在是否有測試過的數(shù)據(jù)可以提供？

           華大智造官網(wǎng)，測試數(shù)據(jù)下載：https://www.mgi-tech.com/Resource/demo/ping_id/3 

Q3：如何實現(xiàn)基因組變異可視化？

           基因組可視化軟件 IGV (Integrative Genomics Viewer) 是高性能的基因組數(shù)據(jù)可視化工具，能夠幫助使用者同時合并分析不同類型的基因組數(shù)據(jù)，并能靈活放大基因組上的某個特定區(qū)域。IGV 軟件免費下載地址: http://www.broadinstitute.org/igv. IGV 可查看 SAM / BAM 比對文件和 VCF 變異檢測文件，下圖顯示的是 IGV 可視化窗口。

Q4：如何尋找候選變異？

           可以使用“人基因組變異交互分析系統(tǒng)”進(jìn)行后續(xù)變異位點篩選，尋找候選變異位點時，可利用變異注釋結(jié)果，關(guān)注非同義突變、剪接突變、移碼突變。

           1)去除千人基因組數(shù)據(jù)庫中 MAF >=1% 的變異

           2)去除 NHLBI-ESP6500 European American 群體數(shù)據(jù)庫中 MAF >=1% 的 變異 

           3)去除 NHLBI-ESP6500 African American 群數(shù)據(jù)庫中 MAF >=1%的變異

           4) 推 測 變 異 的 致 病 性 。 利 用 SIFT/PolyPhen2/Mutation assessor/Condel/FATHMM 進(jìn)行打分，預(yù)測某個變異和氨基酸置換是否影響蛋白 功 能 。

            如 果 score<=0.05 或 PolyPhen2>=0.909 或 MA score>=1.9 或 Condel = deleterious 或 FATHMM=deleterious，就推測該變異可能是有害變異。

Q5：一般用什么方法來驗證 call SNP 準(zhǔn)確率?

           華大炎黃計劃是用 Sanger 測序的方法和芯片分型兩種方法來驗證 SNP 的準(zhǔn)確性的， 因為 Sanger 測序被認(rèn)為是測序中的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

Q6：GWAS后期驗證一般需要用什么方案？客戶已經(jīng)做過GWAS，找出的位點有一些在內(nèi)含子部分，想要進(jìn)行后期驗證。

1、在更大的群體上針對候選位點質(zhì)譜驗證；

2、動物模型上驗證。

Q7：FFPE樣本可以承諾什么指標(biāo)？

           FFPE樣本由于保存年份和降解程度的差異，不同樣本的情況，測序質(zhì)量、duplication比率、覆蓋度等非常不同，屬于風(fēng)險建庫，只承諾Raw data的數(shù)據(jù)量，其他都不能承諾。

Q8：用人唾液測全基因組，效果如何？

           可以做，因為會含有口腔里的微生物，存在污染，一些商業(yè)樣本的結(jié)果顯示，比對率、覆蓋度等均比血液樣本略低。

Q9：突變位點為有效位點時使用的 depth 閾值是多少?

           GATK在call變異時SNP和InDel均要求depth大于等于4 。

Q10：數(shù)據(jù)中的 Duplication 指什么?如何定義?有何影響？

           生物學(xué)意義:由同一個序列經(jīng)過PCR擴(kuò)增而產(chǎn)生的不同的reads，處理的時候去掉這些不同的reads只留一條。

           生物信息學(xué)上意義:跟比對軟件有關(guān); 嚴(yán)格定義:起始和終止坐標(biāo)都一樣，mismatch 的位置和類型都一樣的不同的reads，算duplication; 寬松定義:起始坐標(biāo)一樣的不同的reads，定義為 duplication。位點一樣，堿基也一樣的就是確定的 duplication; 而那些去完 adaptor 之后的信息(起始終止坐標(biāo)，mismatch 位置，類型等)一樣的不同 reads 不一定就是duplication，因為沒有算上去掉的那一部分。與測序深度可能有關(guān)系，理論上，測序深度越高，得到的 duplicate 的 reads 也會越多，因為這些 reads 也會比對到基因組上，在 call SNP 的時候，會對局部的覆蓋深度有影響， 甚至于影響到 SNP 的進(jìn)一步過濾，所以對于變異的檢測也是有干擾的。對于InDel 和 SV 也是類似的。