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UMI Small RNA測(cè)序
UMI Small RNA測(cè)序，文庫構(gòu)建時(shí)引入特異性分子標(biāo)簽（UMI），結(jié)合高通量測(cè)序，研究某物種某組織在特定時(shí)空狀態(tài)下18-30 nt的small RNA片段序列信息，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量，通過與數(shù)據(jù)庫比對(duì), 可實(shí)現(xiàn)small RNA序列的鑒定、靶基因分析和功能分析， 以及包含miRNA、siRNA、piRNA等多種small RNA類型的分析研究需求等。主要應(yīng)用在動(dòng)植物生長發(fā)育調(diào)控研究、抗病抗逆調(diào)控研究、生物性狀及突變調(diào)控研究等；在疾病研究方面，可研究疾病發(fā)生調(diào)控機(jī)制、尋找生物標(biāo)記、靶向藥物研究等。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
1. 實(shí)驗(yàn)方法升級(jí)，數(shù)據(jù)庫更新，sRNA定量結(jié)果更可靠
建庫引入U(xiǎn)MI技術(shù)，實(shí)現(xiàn)無偏向的精確定量，矯正原有70%的reads定量偏差；采用權(quán)威miRBase數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫；
2. 實(shí)驗(yàn)技術(shù)經(jīng)驗(yàn)豐富，低起始量成功率高，技術(shù)重復(fù)性高
已完成350多種不同物種的項(xiàng)目，常規(guī)樣本單次建庫只需100ng，血清血漿樣本只需2ng；小RNA樣本實(shí)現(xiàn)最低1ng起始量；低起始量建庫成功率達(dá)95%；建庫、測(cè)序技術(shù)重復(fù)性高；
3. 多樣的樣品類型，滿足多角度研究需求
接收除常規(guī)樣品以外的血清、血漿樣品、組織液樣品、FFPE樣品、外泌體、RIP富集RNA等多種類型；
4. Dr.Tom系統(tǒng)交付，多種個(gè)性化分析任您選
采用Dr.Tom多組學(xué)數(shù)據(jù)挖掘系統(tǒng)，10大數(shù)據(jù)庫注釋，多維度結(jié)果圖片展示，數(shù)據(jù)圖表循環(huán)挖掘；
5. 無憂解決售后
可根據(jù)客戶需求進(jìn)行貼身個(gè)性化服務(wù)，為文章撰寫提供技術(shù)服務(wù)。
研究內(nèi)容
利用DNBSEQ平臺(tái)，對(duì)富集到的18-30nt的小RNA片段進(jìn)行測(cè)序，對(duì)獲得的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行序列長度分布統(tǒng)計(jì)，將篩選后的高質(zhì)量序列分類注釋，從而獲得樣品中包含的各組分及表達(dá)量信息，并對(duì)所有小RNA片段進(jìn)行注釋，對(duì)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)等分析。
標(biāo)準(zhǔn)信息分析
1. 數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)，對(duì)原始信息采集數(shù)據(jù)去接頭污染，去低質(zhì)量reads
2. small RNA 信息采集結(jié)果的長度分布
3. small RNA在選定的參考基因組上的分布
4. small RNA分類統(tǒng)計(jì)
5. miRNA定量分析
6. miRNA差異表達(dá)分析
7. miRNA表達(dá)/差異表達(dá)聚類分析
8. miRNA靶基因分析
9. 差異miRNA 靶基因GO 注釋和KEGG 通路分析
高級(jí)信息分析
一）數(shù)據(jù)庫注釋
1. 轉(zhuǎn)錄因子注釋（AnimalTFDB/PlantTFDB）
2. GSEA分析
3. Rfam、Pfam、Reactome、COG、EggNOG和InterPro數(shù)據(jù)庫注釋
二）互作網(wǎng)絡(luò)分析
1. 靶基因分析
① miRNA-mRNA靶向關(guān)系分析
② lncRNA-mRNA靶向關(guān)系分析
2. ceRNA互作網(wǎng)絡(luò)分析
3. 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析
4. 共表達(dá)互作網(wǎng)絡(luò)分析
三）特色分析
1. 外部數(shù)據(jù)庫關(guān)聯(lián)分析（TCGA、ARCHS4）
2. 關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因網(wǎng)絡(luò)圖分析
案例一、miRNA機(jī)制研究——以 Rubicon 依賴的方式產(chǎn)生的外泌體 miRNA 參與調(diào)控了細(xì)胞衰老[1]
文章題目：The Rubicon-WIPI axis regulates exosome biogenesis during ageing
發(fā)表期刊：Nature Cell Biology，影響因子 17.3
發(fā)表時(shí)間：2024 年 9月
研究摘要：
細(xì)胞通過在多囊泡體中釋放外泌體與其他細(xì)胞進(jìn)行通信。盡管最近的研究表明外泌體生物合成與自噬之間存在密切聯(lián)系，但詳細(xì)機(jī)制尚未完全闡明。本研究采用全面的 RNA 干擾篩選自噬相關(guān)因子，并發(fā)現(xiàn) Rubicon 作為自噬的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，對(duì)外泌體的釋放調(diào)控至關(guān)重要。Rubicon 招募 WIPI2d 至內(nèi)吞體以促進(jìn)外泌體生物合成，后續(xù)對(duì) WIPI2d 的互作分析鑒定了形成內(nèi)腔小泡所需的 ESCRT 組分。研究還發(fā)現(xiàn) Rubicon 對(duì)于小鼠中外泌體的釋放調(diào)控與年齡增加具有強(qiáng)相關(guān)性。值得注意的是，血清外泌體中的小 RNA 測(cè)序揭示了 Rubicon 決定與細(xì)胞衰老和長壽途徑相關(guān)的外泌體微小 RNA 的生成。綜合來看，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 Rubicon-WIPI 軸作為外泌體生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，并負(fù)責(zé)外泌體中 miRNA 數(shù)量和質(zhì)量的年齡依賴性變化。
部分研究結(jié)果展示：
圖1 Rubicon的缺失與年齡影響外泌體miRNA profile的變化
案例二、疾病miRNA機(jī)制研究——血小板來源外泌體促進(jìn)敗血性休克中性粒細(xì)胞胞外陷阱的形成[2]
研究摘要
血小板已被證明是敗血癥期間中性粒細(xì)胞胞外陷阱（NET）形成的有效激活劑，并且主要來源于血小板的循環(huán)血漿外泌體可能在敗血癥期間誘發(fā)血管凋亡和心肌功能障礙，但血小板源性外泌體在 NET 形成中的作用以及與人類血小板介導(dǎo)NET產(chǎn)生有關(guān)的介體和分子途徑仍不清楚。本次研究通過構(gòu)建體內(nèi)體外敗血癥模型，探究血小板源性外泌體在敗血性休克過程中 NET 形成中的作用及其潛在機(jī)制。
結(jié)果顯示，NET 成分（dsDNA 和 MPO-DNA 復(fù)合物）在敗血性休克患者血液中的外泌體中顯著增加，并且與疾病的嚴(yán)重程度和預(yù)后呈正相關(guān)。在動(dòng)物體內(nèi)模型中，減少血小板可降低血漿外泌體濃度，NET形成以及肺損傷。機(jī)制研究表明，外泌體高遷移率族蛋白1（HMGB1）和/或 miR-15b-5p 和 miR-378a-3p 通過 Akt / mTOR 自噬途徑誘導(dǎo)了 NET 的形成。
研究結(jié)果
圖2 NET形成的增加與敗血性休克期間的死亡率和嚴(yán)重程度有關(guān)
圖3 外泌體miR-15b-5p和miR-378a-3p通過靶向PDK1促進(jìn)NET的形成
案例三、miRNA調(diào)控機(jī)制研究——MiR396-GRFS介導(dǎo)油菜素類固醇對(duì)擬南芥幼苗去黃化過程中光氧化損傷的保護(hù)作用[3]
研究摘要
從暗到光的轉(zhuǎn)化對(duì)于幼苗的存活和生長至關(guān)重要，但是其潛在的調(diào)控機(jī)制仍不完善。植物生長發(fā)育所必需的一類植物甾體激素——油菜素甾體（BRs）和植物特異性轉(zhuǎn)錄因子——生長調(diào)節(jié)因子（GROWTH-regulation FACTORs，GRFs），二者在植物生長發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用。
結(jié)果表明，油菜素甾體缺陷型det2-1突變體的黃化幼苗在光照下積累了過量的原葉綠素，導(dǎo)致光氧化損傷。相反，獲得性功能突變體bzr1-1D抑制det2-1的原葉綠素積累，從而促進(jìn)黃化幼苗的綠化。此外，研究發(fā)現(xiàn)BZR1和PIF4誘導(dǎo)生長調(diào)節(jié)因子GRF7和GRF8抑制葉綠素的生物合成，促進(jìn)幼苗的綠化。過表達(dá)microRNA396a抑制GRFs功能會(huì)在黑暗中引起原葉綠素的積累，并且在曝光后會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的光漂白，BZR1，PIF4和GRF7相互作用，精確調(diào)控葉綠素生物合成基因的表達(dá)。
研究結(jié)果
圖4 油菜素提高了暗生苗的返青率
參考文獻(xiàn)：
[1] Yanagawa K, Kuma A, Hamasaki M, et al. The Rubicon-WIPI axis regulates exosome biogenesis during ageing[J]. Nat Cell Biol. 2024 Aug 22.
[2] Jiao Y, Li W, Wang W, et al.Platelet-derived exosomes promote neutrophil extracellular trap formation during septic shock. Crit Care. 2020 Jun 29;24(1):380.
[3] Wang L, Tian Y, Shi W,et al. The miR396-GRFs Module Mediates the Prevention of Photo-oxidative Damage by Brassinosteroids during Seedling De-Etiolation in Arabidopsis. Plant Cell. 2020 Aug;32(8):2525-2542.
圖1??小RNA分類注釋
通過與已知的sRNA數(shù)據(jù)庫比對(duì)，鑒定小RNA，各類小RNA所占比例。
圖2??差異表達(dá)miRNA聚類熱圖? ?
圖3? 差異miRNA與差異靶基因關(guān)聯(lián)聚類圖
圖4? 差異表達(dá)miRNA與差異靶基因互作網(wǎng)絡(luò)圖
表1 Small RNA組織樣品送樣建議
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組織類型 |
具體要求 |
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新鮮培養(yǎng)細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)） |
≥2×105
cells |
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新鮮動(dòng)物組織干重 |
≥25 mg |
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新鮮植物組織干重 |
嫩葉、嫩莖≥100 mg， 根、果實(shí)、種子、花等≥200 mg |
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全血（哺乳動(dòng)物） |
≥1 mL 全血分離的白細(xì)胞或 ≥1 mL
PAXgene? Blood RNA Tube收集的全血 |
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全血（非哺乳動(dòng)物） |
≥0.1 mL 全血分離的白細(xì)胞或≥0.2 mL 全血＋6倍TRIzol裂解液 |
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FFPE |
≥5片，未染色，100 mm2，5-10 μm厚度 |
表2 Small RNA測(cè)序樣品判定標(biāo)準(zhǔn)
Q1：小?RNA?測(cè)序?qū)悠诽崛∮惺裁刺厥庖螅?
? ? ? ? 提取總RNA時(shí)建議不要使用Qiagen等公司的過柱試劑盒，也不要使用LiCl沉淀，以免丟失小片段RNA。如果直接提供small RNA樣品，可以使用small RNA提取專用試劑盒來進(jìn)行提取。
Q2：華大可以實(shí)現(xiàn)什么類型的樣品建庫測(cè)序？
? ? ? ? ?動(dòng)植物總RNA樣品、微生物總RNA樣品、200nt以內(nèi)的小片段RNA樣品、經(jīng)切膠回收的small RNA樣品、組織培養(yǎng)與細(xì)胞系樣品、血清/血漿樣品、組織液樣品，F(xiàn)FPE樣品、RIP樣品，外泌體樣本等，只要滿足華大送樣要求，均可在華大用于小RNA建庫測(cè)序。
Q3：為什么實(shí)驗(yàn)結(jié)果中會(huì)存在降解的?rRNA序列？?
? ? ? ? 由于?total RNA?常發(fā)生輕微的降解，而生物體內(nèi)也有自然的降解過程，因此數(shù)據(jù)中就會(huì)含有小部分?mRNA?降解片段。但通常這個(gè)比例很低，并且取決于樣品?total RNA?的質(zhì)量。
Q4：進(jìn)行小?RNA?測(cè)序時(shí)，客戶除了樣品以外還需要提供哪些相關(guān)信息？?
? ? ? ? 需要提供相應(yīng)物種的基因組和相關(guān)的?exon、intron、repeat?信息。如果沒有本物種的基因組，需要提供近緣物種的相關(guān)信息。?
?
