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外泌體樣本定制化處理
外泌體是一種由細胞主動分泌的小囊泡，大小均一，脂質雙層膜結構，直徑30-100nm，天然存在于體液中（血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁等），幾乎所有培養的細胞均可分泌外泌體。研究發現，外泌體內包含復雜的核酸和蛋白質，其中許多RNA分子已被證實參與到腫瘤的發生過程，因此對外泌體RNA的研究逐年遞增。
自2007年首次在外泌體中發現mRNA和miRNA，研究者已在人類及小鼠外泌體中發現了數千個不同 mRNA，而且有些轉錄本只存在于外泌體中，在胞內卻無法檢測到，這表明RNA進入外泌體的過程會受到某些特殊的分選機制控制。此外，蛋白質的差異表達是區分不同來源外泌體的重要特點，已成為研究外泌體起源的重要途徑。針對外泌體進行蛋白質組學研究，可以揭示疾病發病機制、尋找疾病診斷和預后的生物標志物、篩選疾病治療靶點等，這些使得外泌體中蛋白質也成為近幾年的一個研究熱點。
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外泌體樣本定制化實驗內容
1. 外泌體分離：超速離心分離法、PEG沉淀法、TIO2富集法（質譜方向新方法）等
2.?外泌體鑒定：外泌體電鏡鑒定、外泌體粒徑檢測、外泌體Western Blot檢測、外泌體納米流式熒光蛋白檢測
3. 外泌體下游研究對象：Small RNA、LncRNA、蛋白質
4. 外泌體下游研究方向：RNA研究、蛋白質譜研究
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產品優勢
1. 年3000例樣本處理經驗
2. 專業外泌體技術咨詢、實驗、優化團隊
3. 個性化一對一實驗方案設計
4. 完善的外泌體實驗體系
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多組學技術流程
華大科技外泌體業務已經處理包括細胞上清、血清、血漿、腦脊液、唾液、乳汁、腹液、羊水、動植物組織樣本等眾多類型的外泌體樣本。
1、透射電鏡鑒定結果展示
大小直徑在80nm左右，較明顯雙層膜立體結構，與外泌體經典結構非常相似，可對分離的外泌體做初步的形態結構判斷。
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2、NanoFCM粒徑濃度檢測
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粒子平均直徑約76.71nm，濃度4.74E+9 Particles/mL，符合外泌體大小定義區間，可在宏觀上對外泌體進行數量及濃度的判斷。
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3、Western Blot蛋白標志物鑒定結果展示
CD63\CD81\TSG100目標條帶清晰明顯，Calnexin陰性指標干凈未顯影，以上可對外泌體樣本進行定性判斷。
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4、納米流式熒光蛋白檢測
利用NanoFCM檢測外泌體表面目的蛋白表達的陽性率結果顯示，表面特征蛋白陽性率≥3%。
1、外泌體分離、鑒定及提取送樣量要求（送樣量僅適用于超速離心法）
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樣本來源 |
鑒定 |
RNA 提取和鑒定 |
|||
|
透射電鏡檢測 |
粒徑及濃度檢測 |
納米流式熒光蛋白檢測（1 個指標） |
WB 檢測（1 個指標） |
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|
外泌體 |
15μL |
15μL |
15μL |
15μL |
400μL |
|
血清/血漿 |
0.5mL |
0.5mL |
0.5mL |
1mL |
5mL |
|
細胞上清液 |
10mL |
10mL |
10mL |
20mL |
100mL |
|
尿液 |
10mL |
10mL |
10mL |
20mL |
100mL |
|
唾液 |
2mL |
2mL |
2mL |
4mL |
15mL |
|
鼻涕 |
2mL |
2mL |
2mL |
4mL |
15mL |
|
腦脊液 |
2mL |
2mL |
2mL |
4mL |
15mL |
|
羊水 |
5mL |
5mL |
5mL |
10mL |
50mL |
|
精液 |
0.5mL |
0.5mL |
1mL |
1mL |
5mL |
|
膽汁 |
0.5mL |
0.5mL |
1mL |
1mL |
5mL |
|
腹水 |
5mL |
5mL |
5mL |
10mL |
50mL |
|
乳液 |
2mL |
2mL |
2mL |
4mL |
15mL |
|
卵泡液 |
2mL |
2mL |
4mL |
8mL |
15mL |
|
糞便上清 |
5mL |
5mL |
5mL |
10mL |
50mL |
|
菌液上清 |
10mL |
10mL |
10mL |
20mL |
100mL |
|
動物組織 |
0.3g |
0.3g |
0.5g |
1g |
3g |
|
植物樣本 |
0.5g |
0.5g |
/ |
/ |
5g |
*備注：默認外泌體濃度 >109 個/mL ， 根據后續實驗及樣本質量對樣本總量要求會有差別，部分實驗（如進行 qRT 驗證 需 10 ng 總 RNA）
2、外泌體分離及提取送樣量要求（送樣量僅適用于試劑盒法）
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樣品來源 |
送樣量 |
|
血清 |
1.5mL |
|
血漿 |
1mL |
|
細胞上清液 |
50mL |
|
外泌體 |
400μL |
3、外泌體質譜送樣量
A、僅質譜檢測（實驗過程中，無需將外泌體單獨分離出來）
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類型 |
送樣量 |
|
血漿 |
≥100μl |
|
血清 |
≥100μl |
|
細胞培養上清液 |
≥15ml |
B、外泌體分離+鑒定
|
類型 |
送樣量 |
|
血漿 |
≥2ml |
|
血清 |
≥2ml |
|
細胞培養上清液 |
≥15ml |
4、血漿組織收集方法建議（用于外泌體分離）
區別于常規血漿分離，用于分離外泌體的血漿需要離心2次，詳細步驟如下：
1) 選取EDTA抗凝采血管或檸檬酸鹽抗凝采血管（不可用肝素管），建議采取10mL全血，采血后上下顛倒混勻8-10次；
2) 可將采血管暫放于4℃冰箱或置于冰盒中，1小時之內進行下一步的離心處理；
3) 從冰箱中取出采血管，與其他離心管配平，采用水平轉子離心機，4℃下1900 x g（3000 rpm）離心10min。此步離心結束后保持離心管4℃制冷狀態；
4) 移液槍小心吸取上層血漿（黃色層）到新的尖底離心管中（避免吸到中間層，中間層包含白細胞和血小板）。通常10 mL全血大約能得到4-5 mL血漿；
5) 將上步得到的血漿進一步離心，4℃下3000 x g離心15 min（或者16,000g離心10 min）或者是過0.8um的無菌濾膜；
注：此步驟去除粘附在細胞殘片上的細胞核酸；
6) 小心吸取上清到1.5mL或2mL離心管中，每管分裝1 .2mL血漿。送樣前可凍存于-20℃或者-80℃。（至少送4管（1.2ml）血漿）；
7）干冰寄送。
5、血清組織收集方法建議（用于外泌體分離）
1) 準備好采血管（無抗凝劑，如EDTA或者是檸檬酸鹽），建議采取10mL全血；
2) 將采血管放于室溫下（15-25℃）至少30min，使血液完全凝集；
3) 采用水平轉子離心機，4℃下1900xg （3000 rpm）離心10min。此步離心結束后保持離心管4℃制冷狀態；
4) 移液槍小心吸取上層血清（黃色層）到新的尖底離心管中，避免打擾到細胞層。通常10 mL全血大約能得到3-5 mL血清；
5) 將上步得到的血清進一步離心，4℃下3000 x g離心15 min（或者16,000 rpm離心10 min）；
6) 小心吸取上清到新的離心管中，避免吸到沉淀，此時沉淀沿離心管外側形成彌散的沉淀；
7) 將所有上清，務必先混勻后再分裝，每管分裝1.1-1.2 mL血清，立即凍存于-20℃或者-80℃，建議送4管。
6、細胞培養液組織收集方法建議（用于外泌體分離）
1) 在細胞融合度達到95%左右時，將細胞用PBS洗三遍后加入10ml無血清培基，48h后收集細胞培基；（此步處理僅供參考，不同的細胞處理方式稍有差異）
2) 收集到的細胞培基，4 °C 下800 × g 離心10 min，去除細胞；
3) 吸取上清于新的離心管中，4 °C 下12,000 × g 離心 30 min；
4) 將上清液過0.22um無菌針頭濾膜；
5) 將同一次實驗的濾液混勻，后分裝于15ml離心管中，每管分裝15ml；
6) 立即凍存于-20℃或者-80℃。干冰寄送，建議寄送至少3管分裝好的細胞培養液（不同類型的細胞培養液外泌體提取得率不一）；
參考文獻：
[1] Lv LH1, Wan YL, Lin Y, et, al. Anticancer drugs cause release of exosomes with heat shock proteins from human hepatocellular carcinoma cells that elicit effective natural killer cell antitumor responses in vitro.J Biol Chem. 2012 May 4;287(19):15874-85.
Q1：可實現什么類型樣本標準化外泌體分離？
答：經驗樣本類型：血漿，血清，細胞培養上清液；
可承接樣本類型：尿液、唾液、鼻涕、腦脊液、羊水、精液、關節積液、乳液、卵泡液以及外泌體；
需評估承接樣本類型：組織（腫瘤組織、脂肪、肌肉、結締組織、骨等）、植物（根、莖、葉、花、果實、種子等）、菌液、海洋生物（貝類、魚類肝臟、肌肉等、藻類等）。
Q2：外泌體鑒定服務包含哪些？
答：根據國際細胞外囊泡學會于2014年發布的指導性聲明文件，目前研究和定義細胞外囊泡的最低實驗要求是證明樣品中存在細胞外囊泡，對于分離提取的外泌體，需要通過以下手段進行確認：
a. 透射電鏡形態學鑒定；
b. Nanosight粒徑分布分析；
c. Westen Blot蛋白標志物鑒定或納米流式熒光蛋白檢測。其中，Westen Blot蛋白標志物鑒定至少需有3個陽性蛋白標志物，1個陰性蛋白標志物，常用指標如下表，如需其它指標請自備抗體。
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常用指標 |
CD9、CD63、CD81、TSG101、Calnexin、Flotillin、EpCAM、HPS70、ADAM10、Ache |
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推薦指標 |
陽性指標CD63、CD81、TSG101，陰性指標Calnexin |
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其他指標 |
提前溝通確認，如抗體庫無，需自行準備 |
Q3：外泌體分離+鑒定+RNA提取標準周期？
答：樣本數≤8個，外泌體分離+RNA提取標準周期，21個工作日；
樣本數≤8個，外泌體分離+鑒定+RNA提取標準周期，21個工作日；
樣本數＞8個，周期需要額外增加。
質譜產品線同上（無需RNA提?。?
