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外來文庫測序
外來文庫測序服務專為已完成樣品前處理并自行構建好文庫的客戶提供。通過使用最先進的高通量測序技術，能夠在短時間內生成高質量的測序數據，確保研究項目能夠及時獲得可靠的結果。
產品優(yōu)勢
- 適配多種類型的文庫，并且其他平臺的文庫也可以經過轉化DNBSEQ? 平臺上進行測序，同時保證原始的文庫序列不發(fā)生改變。
- 避免錯誤累計，DNBSEQ? 平臺基于滾環(huán)擴增（Rolling Circle Amplification, RCA）的線性擴增技術，能夠大大提高測序的準確性。
- DUP率低，獨特的測序策略來提高數據質量和減少重復序列（DUP）的發(fā)生率
- InDel 檢測更靈敏，基于RCA的線性擴增技術能夠降低插入和缺失測序的錯誤率
- 無Index hopping 擔憂，DNBSEQ? 平臺測序的眾多拷貝來源于一個模板，所以由Index hopping帶來的錯誤不會累積
- 測序平臺經驗豐富，文章發(fā)表數量共計9,000+篇，涉及物種豐富的物種類型和不同專業(yè)領域
技術原理
華大基因測序儀采用先進的DNBSEQ? 核心技術，通過儀器氣液系統先將DNA納米球 (DNA nanoball, DNB) 泵入到規(guī)則陣列載片 (Patterned Array) 并加以固定，然后再將測序模板及測序試劑泵入。泵入后的測序模板與載片上的DNB的接頭互補雜交，在DNA聚合酶的催化下，測序模板與測序試劑中的帶熒光標記的探針相結合。接下來，通過激發(fā)熒光基團發(fā)光，不同熒光基團所發(fā)射的光信號被儀器相機采集，經過處理后可轉換成數字信號，傳輸到計算機進行再次處理，最終獲取待測樣本的堿基序列信息。
圖１DNBSEQ測序流程圖
所有跟DNB相關的測序技術都屬于DNBSEQ?。DNBSEQ?測序技術主要包括: DNA單鏈環(huán)化和DNB制備 (Make DNB)，規(guī)則陣列 (Patterned Array)，DNB加載 (LoadDNB)，cPAS (combinatorial Probe Anchor Synthesis，聯合探針錨定聚合測序法)，雙端測序技術 (Pair-end)，以及配套的流體和光學檢測技術、堿基識別 (Basecall) 算法等。
與其他測序技術相比，DNBSEQTM測序技術具有滾環(huán)復制擴增帶來的錯誤累積低和規(guī)則陣列載片帶來的信號密度高等原理性優(yōu)勢，大幅提高了測序準確性；而且，基于DNBSEQTM測序平臺的產出數據重復序列率低 (Dup率低)、有效數據利用率高、標簽跳躍（Index Hopping）少，能有效降低“張冠李戴”的情況。此外，結合PCR free等建庫方法，DNBSEQTM測序平臺擁有更好的SNP和InDel準確性。
技術參數
表格1 SEQ 表格 \* ARABIC 1 測序平臺及對應產量
* 參考產量僅供參考。實際執(zhí)行過程中，根據不同的文庫類型和文庫質量產量可能會有較大幅度的波動。不承諾每個樣品的數據產出及質量。
項目流程
文庫結構
1. DNBSEQ? 平臺文庫：文庫符合 MGI 標準結構（BGI 通用結構或 MGI 雙 index 結構）；
2. 其他平臺文庫：Illumina 標準結構（TruSeq 結構 或 Nextera 結構）、Illumina TruSeq Read 1-Nextera Read 2、Illumina Nextera Read 1-TruSeq Read 2、Illumina TruSeq Small RNA、或 NEB Small RNA。
文庫片段分布
PE100 文庫片段范圍 250-550bp；PE150 文庫片段范圍 300-550bp；文庫片段主峰長度不超過 550bp；PE250/PE300 文庫片段范圍 450-750bp；單一主峰、無明顯拖尾峰、無雜峰、無接頭、無引物二聚體污染。
Barcode/index要求
1. Barcode/index堿基要求：同lane pooling文庫barcode/index堿基平衡，即每個cycle A、T、C、G均有且占比在 8% - 62.5%的范圍內。若barcode/index不平衡則不能保證單lane barcode/index拆分率；
2. 同 lane pooling 文庫中 barcode/index 長度需相同。不同 barcode/index 堿基長度的樣本混合測序，需評估。
樣品準備
1. 樣品質檢：合作伙伴需提供 Qubit、NanoDrop、BMG、AGE、Agilent片段分析儀 或 Caliper LabChip Touch 中一種或多種形式的樣品分析結果，如質檢方法為最后兩種，需附上膠圖或峰圖以供參考。
2. 送樣體積：BGI 只接收 1.5 mL EP 管，要求每管樣品體積不低于最低送樣體積要求，根據實驗要求，如果樣品體積小于 15 μL，BGI 可能會在檢測之前稀釋原始樣品。
3. 樣品前評估：送樣前準確填寫《客戶自建庫信息評估單》并進行評估。
4. 樣品標識一致性：樣本名稱請準確清楚標記于樣本管上，并保證與《客戶自建庫信息評估單》及《客戶自建庫樣品送檢單》一致。
5. 樣品質量標準：樣品質量以 BGI 的質檢結論為準，望合作伙伴理解，檢測結果可能會由于檢測地點， 儀器設備和操作者等不同造成固有差異。
* 更多內容見華大官方文檔《DNBSEQ平臺外來文庫送樣建議》。
Q：Illumina平臺文庫及10x Genomics文庫能在DNBSEQ?平臺上測序嗎？
A: 可以上機，具體支持的文庫類型詳見“送樣建議”。
Q：Pooling文庫上機，有哪些注意事項？
A：為保證最佳的測序質量，Barcode堿基平衡是最理想的狀況，每個cycle A、T、C、G四種堿基都要有，且占比在8% - 62.5%，可允許個別cycle不平衡。歡迎您在咨詢或文庫評估之后，根據我們的建議建庫。
Q：文庫需要自行pooling嗎？
A：您可自行pooling，也可將子文庫送到華大，由我們pooling。
Q：DNBSEQ平臺文庫如何構建？
A：可選擇購買華大智造試劑盒或按照提供的信息自行建庫。
Q：文庫評估需要提供哪些信息？
A：需要提供的信息包括：文庫兩端接頭序列、文庫類型及濃度、文庫對應的Barcode序列、文庫插入片段長度、插入片段是否隨機、文庫結構中特殊序列的具體序列信息及位置等。
