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流式細胞分選
2013年，單細胞技術被《Nature Method》雜志評為年度技術，被《Science》雜志評為六大前沿領域之首。如今隨著高通量單細胞技術方法的推廣，單細胞研究成本降低，單細胞研究服務可以“飛入尋常百姓家”，極大地推動單細胞研究發展。
當然，單細胞研究中，一個很重要的方法——流式細胞分選法的出現，讓單細胞研究可以實現有目的性細胞群體的富集，研究范圍進一步縮小，帶來的是對單細胞群體的精細化了解，讓未來的靶向藥物研究設計和治療更有針對性。
現華大科技引進SONY SH800S Flow Cell Sorter流式細胞分選儀，可實現3規格、4模式，滿足單細胞多種類型研究需求。分選后的細胞能直接用于核酸提取、單細胞PCR擴增或10X Genomics等，可進一步進行細胞基因、功能水平的研究和不同細胞之間的差異化研究。
流式細胞分選技術原理
利用流式細胞分選儀，以高能量激光照射高速流動狀態下被熒光色素染色的單細胞或微粒，測量其產生的散射光和發射熒光的強度，從而對細胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遺傳、分子生物學性狀及功能狀態等進行定性或定量檢測的一種現代細胞分析技術，它可根據發射光的熒光強度和波長將發光顆粒亞群分開并可實現單克隆分選，復雜樣本中的細胞進行分類、定量和分離。
流式細胞儀分選模式
- 單管單細胞分選
- 96孔板/384孔板
- 特定類群細胞分選
流式細胞儀配置
圖1 華大科技流式細胞儀配置圖
流式細胞分選實驗流程
圖2 流式細胞儀分選實驗操作流程圖
產品優勢
多樣：3種規格芯片(70μm/100μm/130μm)，充分滿足不同大小細胞的分選需求；
全面：4種分選模式（0.2μL PCR管/96孔板/384孔板/特殊細胞群），滿足不同類型單細胞研究需求；
先進：創新微流體芯片液流分選系統，全自動化校準；
精準：獨有專利技術，細胞的損傷小，活細胞比例高，純度達99%；
靈活：接受多種組織、細胞系類型，提供組織解離處理。
（一）抗體標記分選：
經抗體標記（CD4-FITC/CD8-PE，Invitrogen）標記的抗凝全血，分選CD4+和CD8+細胞，結果展示如下，觀察到CD4+和CD8+兩類細胞分群明顯，并按照下圖方案，對其中CD4+和CD8+細胞進行圈門。
圖3. 細胞分群結果示意圖
（二）單細胞模式分選：
1. 取96孔板，圈定CD4+細胞，并選擇96孔板分選，single cell模式；
2. 向A1/B1/G2/H2孔分別噴入1個細胞，向C1/D1/E2/F2孔分別噴入10個細胞，向E1/F1/C2/D2孔分別噴入100個細胞，向G1/H1/A2/B2孔分別噴入1000個細胞；
3. 將以上細胞使用smart-seq2方法進行單細胞擴增，并使用 Agilent片段分析儀檢測擴增產物。
結果展示如下圖，文庫主峰大于1kb為正常，且隨著細胞數目增加，產物的量隨之增加。
圖4. smart-seq2擴增文庫2100檢測圖
圖5. 文庫產量圖
（三）細胞類群分選：
1. 取2個15ml離心管，圈定CD4+細胞及CD8+細胞，purity模式兩路分選；
2. 離心管中加入100ul細胞培養液DMEM（Gibco），收集105個細胞；
3. 取分選后的CD4+臺盼藍染色，顯微鏡下觀察，拍照如下圖。
細胞觀察，顯微鏡拍照。臺盼藍不能穿過完整的細胞膜，因此視野里的亮點，是活的細胞；被染藍色的，是死細胞。
圖6. 細胞染色顯微鏡圖
4. 取分選后的CD4+細胞，加入900μL trizol裂解液（Invitrogen），并完成RNA提取實驗；使用Agilent片段分析儀檢測提取產物，結果如下圖，CD4+細胞，提取后的RNA質量良好。
圖7. 提取RNA質量檢測圖
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組織類型 |
詳細要求 |
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單細胞懸液 |
細胞直徑<40 μm、細胞活性>60%；無結團和碎片，細胞密度不超過1×107/mL |
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全血 |
全血樣本在送樣前應充分與抗凝劑混合，確認血樣沒有溶血或凝結，并盡快安排實驗 |
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其他組織 |
送樣前先以無菌PBS清洗后再無菌條件下充分剪為碎塊，依據組織類型選擇合適的完全培養液低溫運輸 |
注意事項：
1、如單一熒光檢測，需要提供未進行標記抗體的細胞一份，作為陰性對照； 如多色熒光檢測，除陰性對照外，還須提供多個單色補償對照。
2、選擇合適的熒光抗體標記目標細胞，當試驗中所涉熒光素超過三種時，請先與生產負責人確認所選熒光抗體是否合適后再行購買。
Q1：流式細胞儀進行分選細胞，怎樣選擇抗體標記？
選擇抗體的原則：
（1）選擇熒光時首先應確認能被流式細胞儀上所配置的激光激發；
（2）激發光譜必須在儀器上濾光片能夠接受的合適范圍內；
（3）盡量使用已經用熒光素標記好的單克隆抗體；
（4）如果是單色實驗，熒光素的亮度越強越好；
（5）如果是多色實驗，除了避免使用光譜高度重疊的熒光素外，還應搭配染色指數。簡單來說，就是用亮度強的熒光素標記抗體水平低的抗原，而用較弱的熒光素標記抗體水平高表達的抗原。
Q2：抗體需要客戶提供嗎？
需要，華大也會配備5種抗體（物種：人），CD3/ CD4/ CD8/CD19/CD45。
Q3：哪些情況下必須用流式細胞儀來進行細胞分選？
（1）要求目標細胞群有極高的純度（95%-100%）；
（2）需要分選低密度表面受體/抗原的細胞（弱陽性細胞）；
（3）需要根據表面受體密度的差別來分離不同細胞（根據免疫表型的分選、抗體親和力進化等）；
（4）需要依據多色熒光標記來分選細胞；
（5）根據某些細胞內部標志，如DNA含量、包內抗原等分離細胞；
（6）多孔板分選，如96孔板或384孔板中精確的分選出1個細胞；
（7）分選含量極低的細胞（0.001%或更低），流式可分選出百萬分之一的稀有細胞。
Q4：MACS和FACS進行細胞分選的優缺點？
MACS（magnetic-activated cell sorting），原理就是用結合了磁珠的抗體去標記細胞，讓目的細胞帶上磁珠，通過磁場將結合了磁珠與沒結合磁珠的細胞分離開來。
FACS（fluorescence-activated cell sorting），流式分選則是利用熒光素標記不同的分子，通過調節合適的電壓、補償等，通過熒光將目的細胞與非目的細胞區分開來。華大科技引進的SONY流式細胞分選平臺，在保證分選純度的同時，通過專利技術降低分選過程對細胞的損傷，并支持各種收集管耗材，還可以實現索引分選。
FACS與MACS的比較
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比較內容 |
FACS |
MACS |
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設備 |
具有分選功能的流式細胞儀 |
專用的磁鐵和柱子 |
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試劑 |
熒光抗體 |
磁珠結合抗體 |
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操作人員要求 |
需專業培訓 |
操作簡單 |
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對細胞刺激 |
稍大 |
小 |
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多種標記細胞 |
可以分選 |
不能分選 |
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表達豐度低的細胞 |
可以分選 |
不能分選 |
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識別細胞大小和顆粒度 |
可以識別 |
不能識別 |
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多種細胞分選 |
兩路同時分選 |
一次只能分選一種細胞 |
Q5：如果我想在分選后拿到1×105個細胞，用于單細胞研究，那么應該準備多少細胞來做分選？
首先需要確認，要分選的目的細胞占總細胞數的占比。
以PBMC分選T細胞為例，其中T細胞占比約70%，
PBMC are not a homogenous cell population but are constituted by several immunecell types including, among others, B cells (~15 %), T cells (~70 %), monocytes (~5 %), and natural killer (NK) cells (~10 %)。
細胞數要求是≥105= 所需細胞總數*目標細胞占比（變量）%*分選純度98%（固定值）*分選效率80%（固定值，根據分選模式會有差異, 高速分選、 純度模式(purity vs. yield mode)、部分細胞黏附于上樣管壁、部分細胞用于樣本分析、長時間分選過程中細胞的死亡等等，對會降低回收率。80%回收率是一個一般的參考值）
根據計算，100000/80%/98%/70%（變量）= 182215 ，所以約為~20W個細胞總數。其他以此方法進行計算類推。
