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非靶向代謝組學
基于液質聯用技術（LC-MS），無偏向性、盡可能多地檢測細胞、組織、器官或體液等生物樣本內所有的小分子代謝物，對實驗組和對照組進行對比分析，通過統計分析篩選差異代謝物，對差異代謝物進行代謝通路分析，進而尋找代謝物與生理病理變化的相對關系。
技術優勢
1. 代謝物鑒定準確度高
使用標準品數據庫鑒定，提供鑒定可信度分級注釋，鑒定總數4,000+
2. 超高分辨率質譜平臺
使用QE系列譜儀進行檢測，儀器分辨率高、質量精度高、穩定性好
3. 規范化平臺嚴格質控
全流程標準操作程序（SOP）指導，同位素內標與QC雙重質控
4. 大樣本項目經驗豐富
高通量自動化樣本制備系統進行代謝物提取，實時監控儀器檢測過程
5.分析創新
創新性引入相關性差異分析，通過多維信息整合，穩健算法直擊核心功能，精準鎖定關鍵機制。
產品應用
- 疾病診斷、發病機理及預后研究
- 微生物感染及發病機理研究
- 腸道菌群與疾病研究
- 機體發育調控研究
- 藥物作用機制及靶點研究
- 天然藥物研究與新藥篩選
技術路線
技術參數
1. 儀器平臺
LC-MS/MS：液相-Waters ACQUITY UPLC，質譜-Thermo Q Exactive / Q Exactive HF/Q Exactive HF-X等Orbitrap系列質譜儀
2. 分析軟件
Compound Discoverer（Thermo, USA），metaX (華大自主開發的代謝組學分析軟件包)
3. 數據庫
華大代謝組數據庫(BGI MDB, BGI Metabolome Database) ，包含保留時間、一級質譜和二級質譜信息
mzCloud 在線標準品數據庫，包含一級質譜和二級質譜信息，化合物數量30,000+
其他數據庫 HMDB、KEGG、LIPID MAPS等
項目周期
30-60個自然日
案例一：L-肉堿治療后敗血性休克1年存活患者和死亡患者之間代謝組差異[1]
研究背景：
敗血性休克具有40%的致死率，L-肉堿是治療敗血癥休克的候選治療藥物。患者對L-肉堿的反應可能取決于其獨特的代謝特征，而這些特征在臨床表型中并不明顯。為更好地了解敗血癥患者的代謝變化與以患者為中心的預后之間的關系，對接受L-肉堿治療的患者血清樣本采用非靶向代謝組學的手段檢測。
技術路線：
圖1 研究技術路線
主要結論：
1. 對L-肉堿和安慰劑治療后的患者代謝組數據進行熱圖分析發現L-肉堿治療后存活和死亡患者代謝組成具有明顯差異，且接受安慰劑治療的患者具有顯著異質性。
圖2 不同處理組之間代謝物熱圖分析
2. 對接受L-肉堿治療的患者不同時間點（T0h、T24h、T48h）取樣分析，發現酰基肉堿的水平升高，但是整體代謝組并沒有發生劇烈擾動。
3. 接受L-肉堿治療后的1年存活患者和死亡患者具有顯著的代謝表型差異，表明這些差異的代謝物可能是體內代謝過程紊亂的副產物；包括纖維蛋白肽A、醛賴氨酸、組胺等幾種與血管炎癥相關的幾種代謝標記物在死亡患者中顯著上調。這些代謝指標的變化可以用做評估患者預后反應差異。
案例二：代謝組學研究早期結直腸癌生物標志物[2]
研究背景：
本研究是對結直腸癌（CRC）診斷生物標志物的研究，而流行病學研究表明代謝綜合征增加了患結直腸癌的風險，且癌癥的早期篩查能夠有效地增加患者5年生存率，代謝組學對研究系統生物學小分子生物標志物有重要意義。本研究旨在為CRC的診斷確定可靠的血清生物標志物。
研究內容：
樣本選擇：人血清樣本
隊列選擇：篩選隊列（360例）、驗證隊列（1,594例）、驗證隊列（900例）、預測隊列（1,528例）
研究方法：非靶向代謝組、靶向代謝組
技術路線：
圖1 技術路線圖
主要發現：
1. 篩選隊列：選擇360血清個樣本（120例健康人、120例代謝綜合征患者、120例結直腸癌患者）進行非靶向代謝組學代謝物篩選，通過兩兩比較組分析得到30個差異表達代謝物，通過通路注釋分析發現這些差異代謝物主要與苯丙氨酸代謝途徑、甘油磷脂代謝途徑、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成途徑相關。
圖2 差異代謝物聚類分析
2. 確認隊列：采用1,594個獨立隊列（580例健康人、577例代謝綜合征患者、437例結腸癌患者）進行驗證，利用PCA和OPLS-DA分析得到7個代謝物可作為潛在的生物標志物，通過與疾病表型進行關聯分析和二元邏輯回歸分析確定酪氨酸、谷氨酰胺-亮氨酸作為生物標志物，能夠明確的區分健康人群和結直腸癌患者。
圖3 確認隊列中篩選7種潛在生物標志物
3. 驗證隊列、疾病預測隊列：接著對酪氨酸、谷氨酰胺-亮氨酸這2個生物標志物通過900個驗證隊列，采用受試者特征曲線分析進一步評估了這2個生物標志物的準確性；最后挑選1528個人群作為預測隊列，分別評估標志物的診斷能力的可靠性。
圖4 驗證隊列對2種生物標志物驗證
參考文獻
[1] Evans, Charles R., et al. "Untargeted metabolomics differentiates L-carnitine treated Septic shock 1-year survivors and nonsurvivors." Journal of proteome research 18.5 (2019): 2004-2011.
[2] Li, Jiankang, et al. "Tyrosine and Glutamine-Leucine Are Metabolic Markers of Early-Stage Colorectal Cancers." Gastroenterology 157.1 (2019): 257-259.
1. 數據預處理及質控分析
使用Compound Discoverer軟件進行LC-MS/MS數據處理，主要包括峰提取、峰對齊和代謝物鑒定等一系列分析。Compound Discoverer導出的數據通過metaX進行數據預處理、質控分析和后續分析。數據質控的內容包括，QC樣本的BPC重疊圖、所有樣本的PCA分析、各組的CV分析。
圖1 數據質控分析
2. 代謝物的檢測和鑒定情況
（1）代謝物檢測數和鑒定數統計
對數據預處理后的代謝物檢測數量和鑒定數量統計如下表。
表1 代謝物檢測數和鑒定數統計表
|
離子模式 |
代謝物檢測數 |
代謝物鑒定數 |
|
pos |
5,182 |
2,359 |
|
neg |
2,749 |
1,291 |
pos—正離子模式，neg—負離子模式。
（2）代謝物的分類注釋和功能注釋分析
圖2 代謝物的分類注釋和功能注釋統計圖
3. 差異代謝物的篩選
通過PCA分析觀察了解兩組樣本的差異情況。采用多變量分析PLS-DA模型前兩個主成分的VIP值，結合單變量分析差異變化倍數（Fold Change, FC）和T檢驗（Student's t-test）的q-value值來篩選差異表達的代謝物。篩選條件: 1）VIP ≥ 1；2） Fold-Change ≥1.2 或者 ≤ 0.8333；3） q-value < 0.05，同時滿足這三個條件，即為差異代謝物。
圖3 差異代謝物的篩選
4. 差異代謝物分析
包括差異代謝物的聚類熱圖分析和差異代謝物的代謝通路富集分析。
圖4 差異代謝物的分析
1. 重復數要求
每組樣本的生物學重復次數要求如下，重復次數越多越好。
表1 生物學重復次數要求
|
樣本類型 |
重復次數要求 |
|
植物、微生物、細胞樣本 |
≥ 6個 |
|
動物樣本 |
≥
10個 |
|
臨床樣本 |
≥ 30個 |
2. 送樣量要求
表2 送樣量要求
樣本類型 | 建議送樣量/例 |
血清、血漿、尿液、血淋巴、腦脊液、房水 | ≥200 μL |
濾紙條、拭子 | ≥4條 |
外泌體（須是分離好的外泌體） | ≥500μL，約1011 Particles/mL |
精漿、羊水、前列腺液、瘤胃液、呼吸冷凝液、胃灌洗液、肺泡灌洗液、汗液、唾液、痰液、牛奶、細胞培養液、發酵液 | ≥500 μL |
動物及臨床組織、糞便、腸道內容物、微生物菌體、脊髓、軟骨 | ≥100 mg |
細胞 | 107 個 （需每份樣本細胞數目保持一樣） |
酒曲、酒醅、大曲發酵物等 | ≥500mg |
土壤、淤泥、海水沉積物 | ≥500mg |
Q1：“非靶向代謝組學”的代謝物鑒定數量是多少？
A1：代謝物鑒定數一般可以達到4,000+，鑒定結果的準確度和數量在行業內屬于領先水平。代謝物鑒定數的多少也與樣本本身的含有的代謝物數量多少有關，不同物種、不同組織器官樣本代謝物種類含量不同；如果樣本中的代謝物數量本身就比較少，那么檢測和鑒定到的代謝物數量也可能會少一些，以具體項目的檢測鑒定情況為準。
Q2：同一代謝物在不同處理組是可以相互比較的，那么同一個個體，鑒定到的不同代謝物之間離子強度是否也可以進行相對定量的比較？或者需要一個內參？
A2：不同代謝物一般不可進行相對定量比較。由于不同的代謝物響應不同，它們之間往往是不可比的。比如，代謝物A與B在樣本中的濃度相同，但代謝物A的響應率為代謝物B的100倍，那么質譜檢測的代謝物A的響應比B高，但并不代表A的濃度比B高。由于一個代謝物的響應率一般是不變的，因此一個代謝物在不同樣本中的響應是與其在樣本中的濃度成正相關的。不同樣本中相同代謝物是可比的。
