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非靶向植物代謝組學
以植物為研究對象，研究不同物種、不同基因類型或不同生態類型的植物在不同生長時期或受某種刺激前后的小分子代謝產物。基于液質聯用技術（LC-MS），無偏向性、盡可能多地檢測植物樣本內所有的小分子代謝物，對實驗組和對照組進行對比分析，通過統計分析篩選差異代謝物，對差異代謝物進行代謝通路分析，進而尋找代謝物與生理病理變化的相對關系。
華大高分辨植物代謝數據庫（BGI HRAM-PMDB 1.0）
技術優勢
1. 高質量自建庫
所有代謝物均通過標準品建庫，均包含一級質譜、二級質譜和保留時間信息
2. 代謝物鑒定準確度高
60種標準品校正保留時間，100% 比對標準品鑒定，鑒定數可達1500+
3. 規范化平臺嚴格質控
全流程標準操作程序（SOP）指導，同位素內標與QC雙重質控
4. 超高分辨率質譜平臺
使用Orbitrap系列譜儀進行檢測，儀器分辨率高、質量精度高、穩定性好
5.分析創新
創新性引入相關性差異分析，通過多維信息整合，穩健算法直擊核心功能，精準鎖定關鍵機制。
產品應用
1. 植物生長發育研究
2. 農作物品質性狀與育種改良研究
3. 植物生物和非生物逆境互作研究
4. 果蔬花卉營養和色澤代謝研究
5. 藥用植物功能與活性成分研究
6. 基因功能解析與代謝通路研究
技術路線
技術參數
1. 儀器平臺
LC-MS/MS：液相-Waters ACQUITY UPLC，質譜-Thermo Q Exactive / Q Exactive HF / Q Exactive HF-X
2. 分析軟件
Compound Discoverer（Thermo, USA），metaX (華大自主開發的代謝組學分析軟件包)
3. 數據庫
華大高分辨植物代謝組數據庫( BGI HRAM-PMDB)，包含保留時間、一級質譜和二級質譜信息，化合物數量2500+
mzCloud 在線標準品數據庫，包含一級質譜和二級質譜信息，化合物數量30,000+
項目周期
30-60個自然日
案例一：代謝組學研究植物-線蟲互作機制[1]
研究背景：
根際微生物及線蟲能很大程度地影響植物的健康，其中代謝物小分子信號轉導在植物根際的相互作用發揮著重要作用。通常植物和動物在受到病原體攻擊時，可以通過識別病原體相關的進化保守的大分子（PAMPs）來誘導激活免疫反應，這種免疫激活的方式被稱為pattern-triggered immunity（PTI）。線蟲蛔苷是植物寄生線蟲分泌的一種保守的糖脂，可以通過PTI誘導植物免疫反應，在植物根際相互作用中起著重要作用，但是目前線蟲蛔苷誘導植物免疫的分子機理還未被發現。
圖1 植物通過識別和代謝ascr#18介導免疫反應
技術路線：
通過對不同植物（擬南芥、番茄、小麥）在不同處理的條件下（假單胞菌DC3000侵染、線蟲侵染、外援物質添加）的組織及根系分泌物進行代謝組分析，發現植物可以通過代謝植物寄生線蟲分泌的線蟲蛔苷ascr#18生成一系列蛔苷混合物來介導免疫反應。
主要結論：
1.? 對比是否經過ascr#18處理的植物組織的代謝數據，發現植物能將ascr#18代謝成一系列蛔苷的混合物如ascr#10，ascr#1，ascr#9，其中ascr#9是含量最豐富的蛔苷代謝物；
2.? 通過比較野生型及突變型擬南芥（β氧化關鍵酶缺失菌株）經ascr#18處理后的組織代謝物水平，觀察出植物可以通過β氧化將ascr#18代謝成其他蛔苷；
3.? 分別對ascr#18處理后的野生型及突變型擬南芥做假單胞菌DC3000及線蟲侵染實驗，發現ascr#18代謝是提高植物對線蟲侵染的抗性所必需的，但不是植物抵抗細菌所必需的；
4.? 對野生型及突變型擬南芥進行ascr#18處理后，發現ascr#18可能不是通過誘導防御基因的表達來提高植物對線蟲的抗性的
5.? 野生型擬南芥根系能夠分泌ascr#18的代謝物ascr#10，ascr#1及ascr#9，其中ascr#9與ascr#18相結合可以抑制線蟲對植物的侵染。
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案例二：代謝組學結合轉錄組學探究高修飾脂肪酸的合成途徑[2]
研究背景：
雖然初級脂肪酸可以抵抗病原體，但是植物通常還會對這些脂質加以修飾用于應對生物脅迫。其中炔類脂肪酸這種修飾的氧化脂質廣泛分布于各種植物中，用于抵抗病原體，但其合成和代謝途徑卻并沒有被發現，這限制了我們對植物抗性的認知及對這類脂質的開發利用。
圖2 代謝組學結合轉錄組學探究法卡林二醇的合成途徑
技術路線：
采用非靶向代謝組學及轉錄組測序相結合的方法，對不同微生物處理后的番茄樣本進行分析，篩選出與番茄抗性有關的代謝物及其相關的基因，確定并驗證與代謝物相關的基因簇，并進一步對其進行功能探究。
主要結論：
1.? 在不同微生物脅迫的番茄樣本中，包括法卡林二醇在內的一系列代謝產物的表達發生了明顯改變。
2.? 通過將轉錄組和代謝組數據關聯分析，發現6個與法卡林二醇表達量更相關的基因，其中4個位于12號染色體的同一區域組成基因簇，可能與其代謝有關。
圖3 法卡林二醇的EIC及其6個候選乙炔酶基因在不同樣本中的表達量關聯圖
3.? ?結合瞬時表達及代謝組實驗對基因簇的相關酶功能進行的驗證發現兩個乙炔酶、一個去飽和酶及一個暫未表現出活性的蛋白；基因突變試驗及代謝實驗的結果則該基因簇是證明法卡林二醇的合成所必需的。
4.? 番茄野生型植株和突變株與病原菌的相互作用試驗則表明法卡林二醇的合成基因簇參與法卡林二醇誘導的番茄免疫反應，基因簇上相關基因的缺失也會導致番茄抗性的改變。
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參考文獻
[1] Manohar, Murli, et al. "Plant metabolism of nematode pheromones mediates plant-nematode interactions."?Nature Communications?11.1 (2020): 1-11.
[2] Jeon, Ju Eun, et al. "A Pathogen-Responsive Gene Cluster for Highly Modified Fatty Acids in Tomato."?Cell?180.1 (2020): 176-187.
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1、數據預處理及質控分析
使用Compound Discoverer軟件進行LC-MS/MS數據處理，主要包括峰提取、峰對齊和代謝物鑒定等一系列分析。Compound Discoverer導出的數據通過metaX進行數據預處理、質控分析和后續分析。數據質控的內容包括，QC樣本的BPC重疊圖、所有樣本的PCA分析、各組的CV分析。
圖1 數據質控分析
2、 代謝物的檢測和鑒定情況
（1）代謝物檢測數和鑒定數統計
對數據預處理后的代謝物檢測數量和鑒定數量統計如下表。
表1 代謝物檢測數和鑒定數統計表
|
離子模式 |
代謝物檢測數 |
代謝物鑒定數 |
|
pos |
14604 |
1058 |
|
neg |
12484 |
579 |
pos—正離子模式，neg—負離子模式。
（2）代謝物的分類注釋和功能注釋分析
圖2 代謝物的分類注釋和功能注釋統計圖
3、差異代謝物的篩選
通過PCA分析觀察了解兩組樣本的差異情況。采用多變量分析PLS-DA模型前兩個主成分的VIP值，結合單變量分析差異變化倍數（Fold Change, FC)）和T檢驗(Student's t-test）的q-value值來篩選差異表達的代謝物。篩選條件: 1）VIP ≥ 1；2） Fold-Change ≥1.2 或者 ≤ 0.8333；3） q-value < 0.05，同時滿足這三個條件，即為差異代謝物。
圖3 差異代謝物的篩選
4、差異代謝物分析
包括差異代謝物的聚類熱圖分析和差異代謝物的代謝通路富集分析。
圖4 差異代謝物的分析
1、 重復數要求
每組樣本的生物學重復次數要求如下，重復次數越多越好。
|
樣本類型 |
建議重復次數 |
|
植物樣本 |
≥ 6 個 |
2、 送樣量要求
樣品類型 | 建議送樣量/例 |
新鮮植物組織 | ≥500 mg |
凍干植物組織 | ≥ 200 mg |
中藥藥湯 | 凍干粉≥200 mg，藥液≥1mL |
中藥藥丸 | ≥1g |
Q1：“非靶向植物代謝組學”的代謝物鑒定數量是多少？
A1：代謝物鑒定數（“RT+MS+MS2”或“MS+MS2”鑒定）一般可以達到800-1500，鑒定結果的準確度和數量在行業內屬于領先水平。代謝物鑒定數的多少也與樣本本身的含有的代謝物數量多少有關，不同物種、不同部位的樣本代謝物數量不同，如果樣本中的代謝物數量本身就比較少，那么檢測和鑒定到的代謝物數量也可能會少一些，以具體項目的檢測鑒定情況為準。
Q2：華大“非靶向植物代謝組學”的代謝物鑒定結果可信度如何？
A2：華大“非靶向植物代謝組學”代謝物鑒定使用“RT+MS+MS2”或“MS+MS2”與標準品數據庫進行比對，具有很高的可信度。
