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脂質組學
脂質組學是對生物體內的脂質進行系統分析的一門新興學科, 是代謝組學的重要分支。基于液質聯用技術（LC-MS），無偏向性、盡可能多地檢測細胞、組織、器官或體液等生物樣本內所有的脂質分子，對實驗組和對照組進行對比分析，通過統計分析篩選差異脂質分子， 進而尋找脂質代謝變化與生理病理變化的相對關系，揭示脂質在各種生命活動中的作用機制。
技術優勢
1. 脂質分子鑒定準確度高
比對二級質譜圖鑒定，鑒定數1000左右，進行脂質大類、亞類、種屬、分子多層次分析
2. 超高分辨率質譜平臺
使用 Orbitrap 系列譜儀進行檢測，儀器分辨率高、質量精度高、穩定性好
3. 規范化平臺嚴格質控
全流程標準操作程序（SOP）指導，同位素內標與QC雙重質控
4. 大樣本項目經驗豐富
高通量自動化樣本制備系統進行代謝物提取，實時監控儀器檢測過程
5. 分析創新
創新性引入相關性差異分析，通過多維信息整合，穩健算法直擊核心功能，精準鎖定關鍵機制。
產品應用
1. 脂質的鑒定與功能研究
2. 脂質生物標志物發掘
3. 脂質代謝途徑和網絡研究
技術路線
技術參數
1. 儀器平臺
LC-MS/MS：液相-Waters ACQUITY UPLC，質譜-Thermo Q Exactive / Q Exactive HF / Q Exactive HF-X
2. 分析軟件
LipidSearch（Thermo, USA），metaX (華大自主開發的代謝組學分析軟件包)
3. 數據庫
LipidSearch配套數據庫，脂質組數據庫，包含一級質譜和二級質譜信息，覆蓋8大類脂質、300種脂質亞類，包含超過170萬個脂質離子及其預測碎片離子的信息
項目周期
30-60個自然日
案例一： 首個中國人群糖尿病非靶向血漿脂質組研究（華大合作發表）[1]
研究背景：
血脂異常和II型糖尿病（T2D）之間的聯系已經被廣泛報道，但II型糖尿病發展過程中的脂質全譜變化，尤其是在東亞人群中的特點，并未完全闡述清楚。通過研究中國II型糖尿病患者、糖尿病前期與糖耐受正常人群的血漿脂質代謝物組成及差異，可為亞洲人群的脂代謝研究提供參考。
實驗設計：
樣品：293個中國人的血漿樣本，其中有114位II型糖尿病（T2D）患者，81位早期糖尿病患者（prediabetic），98位血糖正常的人（NGT）
研究方法：基于LC-MS/MS技術的脂質組學
實驗結果：
脂質組檢測共獲得11,077 個特征峰，其中約46.77%可以匹配到一或多個脂質分子或脂類化合物。通過PERMANOVA 發現，脂質組數據和幾個血漿參數以及生理情況密切相關。
共有1590 個峰在三個實驗組中有顯著差異，790 個可能匹配上脂質分子或脂類化合物。成對比較揭示出1269 個特征峰在NGT 和T2D 之間有顯著差異，prediabetic 與NGT 和T2D 比較，分別有785 和578 個特征峰有顯著差異，暗示著與NGT 相比，prediabetes 和T2D 擁有更為相似的脂質組。這些結果顯示，從NGT 到prediabetes 再到T2D，代謝物會發生持續地變化。
圖1-2 三組兩兩比較顯著差異脂質的韋恩圖；基于脂質全譜的隨機樹分類
主要結論：
1. 脂質組數據和幾個血漿參數以及生理情況密切相關
2. 從NGT到prediabetes再到T2D，脂質會發生持續地變化
3. 成功構建28個特征峰模型，用于指示T2D的發生發展。AUC=90.23%
4. 揭示脂質分子和糖尿病的臨床指標之間的相關性
案例二：脂質組學介導植物乙烯通路水解酶MHZ11功能的研究[2]
研究背景：
作為重要的植物激素，乙烯參與調節植物的生長、發育、應激反應等重要的生理過程。在擬南芥中，乙烯信號通路已經被揭示——乙烯和固定在內質網膜上的乙烯受體結合后，使受體轉為非活性態，不能激活下游的CTR1，使得EIN2去磷酸化從而激活乙烯信號轉導通路。但是在水稻中具體CTR1是如何調節乙烯信號通路的仍有待發現。
技術路線：
作者發現了一個水稻突變株mhz，其根部乙烯信號通路受到阻滯，隨后通過分子生物學實驗及脂質組學對關鍵蛋白MHZ11的底物及其參與到乙烯信號調節通路的調控規律進行研究。
主要結論：
1. 水稻突變株mhz11顯示出根部對乙烯不敏感的特異性表型，基因分析發現其MHZ11基因發生，MHZ11作為正調控因子參與到水稻根部的乙烯信號調節通路中。
2. MHZ11是一個沒有特異性的脂肪酶，通過脂質組學分析發現MHZ11可能參與磷脂的水解生成FFA，FFA可參與后續酯類的合成。
圖3 水稻（野生型WT，突變株mhz11，MHZ11過表達株OE-4）根部的脂質表達統計圖
3. MHZ11具有水解酶的活性，能夠通過水解磷脂生成lyso-PE，FFA后與甾醇反應生成甾醇酯，膜表面甾醇含量的減少影響到乙烯受體及OsCTR1的相互作用，從而介導了下游乙烯信號通路的激活。
圖4 MHZ11參與乙烯通路可能的過程圖
參考文獻
[1] Zhong, Huanzi, et al. "Lipidomic profiling reveals distinct differences in plasma lipid composition in healthy, prediabetic, and type 2 diabetic individuals." Gigascience 6.7 (2017): gix036.
[2] Zhao, He, et al. "The GDSL lipase MHZ11 modulates ethylene signaling in rice roots." The Plant Cell 32.5 (2020): 1626-1643.
1、數據預處理及質控分析
使用LipidSearch 軟件進行LC-MS/MS數據處理，包括智能峰提取、脂質鑒定、峰對齊等的一系列分析。LipidSearch導出的數據通過metaX進行數據預處理、質控分析和后續分析。數據質控的內容包括，QC樣本的BPC重疊圖、所有樣本的PCA分析、各組的CV分析。
圖1 數據質控分析
2、鑒定及定量結果展示
（1）脂質分子數和亞類數的鑒定概況
國際脂質分類和命名委員會(International Lipid Classification and Nomenclature Committee)將脂類化合物分為八大類別(Category),每個類別又分為不同的大類（Main Class）,每個大類可以根據極性頭基的不同分為不同的亞類(Sub Class),每一亞類根據碳鏈不飽和度或長度等的差異分為不同的分子種屬(Molecular Specie),每個分子種屬對應多個不同的脂質分子（Lipid Molecule），構成脂類化合物的五級分類。對數據預處理后的脂質分子數量和亞類數量進行統計。
表1 脂質分子數量統計表
|
Lipid_Molecules_Number |
Sub_Classes_Number |
|
1208 |
36 |
（2）脂質亞類的鑒定及定量分析
圖2 脂質亞類的鑒定和定量分析
3、差異脂質分子的篩選
通過PCA分析觀察了解兩組樣本的差異情況。采用多變量分析PLS-DA模型前兩個主成分的VIP值，結合單變量分析差異變化倍數（Fold Change, FC)）和T檢驗(Student's t-test）的q-value值來篩選差異表達的脂質分子。篩選條件: 1）VIP ≥ 1；2） Fold-Change ≥1.2 或者 ≤ 0.8333；3） q-value < 0.05，同時滿足這三個條件，即為差異脂質分子。
圖3 差異脂質分子的篩選
4、差異脂質分析
包括差異脂質分子的聚類熱圖分析和差異脂質分子的相關性分析。
圖4 差異脂質分子的分析
1、 重復次數要求
每組樣本的生物學重復次數要求如下，重復次數越多越好。
表1 生物學重復次數要求
|
樣本類型 |
重復次數要求 |
|
植物、微生物、細胞樣本 |
≥ 6個 |
|
動物樣本 |
≥ 10個 |
|
臨床樣本 |
≥ 30個 |
2、 送樣量要求
表2 送樣量要求
樣本類型 | 建議送樣量/例 | |
血清、血漿、尿液、血淋巴、腦脊液、房水 | ≥200 μL | |
濾紙條、拭子 | ≥4條 | |
外泌體（須是分離好的外泌體） | ≥500μL，約1011 Particles/mL | |
精漿、羊水、前列腺液、瘤胃液、呼吸冷凝液、胃灌洗液、肺泡灌洗液、汗液、唾液、痰液、牛奶、細胞培養液、發酵液 | ≥500 μL | |
動物及臨床組織、糞便、腸道內容物、微生物菌體、脊髓、軟骨 | ≥100 mg | |
細胞 | 107 個 （需每份樣本細胞數目保持一樣） | |
酒曲、酒醅、大曲發酵物等 | ≥500mg | |
土壤、淤泥、海水沉積物 | ≥500mg | |
植物樣本 | 新鮮植物組織 | ≥500 mg |
凍干植物組織 | ≥ 200 mg | |
中藥藥湯 | 凍干粉≥200 mg，藥液≥1mL | |
中藥藥丸 | ≥1g | |
Q1：為什么要使用質譜正負離子模式同時采集的方式進行分析？
A1: 不同的脂質在正（負）離子模式下電離的程度不同，如PC在正離子模式下更容易電離，而PE在負離子模式下更容易電離，同時采用正負離子模式對脂質組學進行數據采集，可以擴大脂質的覆蓋度。
Q2：為什么要進行生物學重復？
A2：樣本量少得到的結果個體差異可能會超越組間差異，使得結果可信度不高，甚至可能無法篩選出差異脂質 。因此對于不同的樣本類型有不同的生物學重復次數要求。
