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蛋白質(zhì)組+轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析
生命體是一個多層次、多功能的復(fù)雜結(jié)構(gòu)體系，涉及一套精細的表達調(diào)控機制，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯調(diào)控和翻譯后調(diào)控等。僅用單一組學(xué)數(shù)據(jù)很難對復(fù)雜性狀的遺傳特性和生物網(wǎng)絡(luò)調(diào)控進行解釋。
基于多組學(xué)的整合分析至關(guān)重要，能夠彌補單一組學(xué)數(shù)據(jù)缺失、噪音干擾等因素帶來的問題。其次，多組學(xué)數(shù)據(jù)之間相互驗證，能減少單一組學(xué)分析帶來的假陽性。重要的是，多組學(xué)數(shù)據(jù)聯(lián)合分析更有利于對生物學(xué)模型進行表型和遺傳過程調(diào)控機制的深入研究。
轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組是基因組在RNA和蛋白質(zhì)兩個層面的表達產(chǎn)物，對其進行多組學(xué)整合分析有利于研究基因表達過程的多級調(diào)控，能獲得基因表達的全景圖，為醫(yī)學(xué)研究、藥物研發(fā)、農(nóng)業(yè)發(fā)展等各領(lǐng)域提供更全面的信息。
技術(shù)優(yōu)勢
- 高質(zhì)量的自主測序平臺
滾環(huán)擴增構(gòu)建DNB測序文庫，PCR擴增錯誤不累積，無index hopping之憂，低dup rate無需人為干預(yù)。
- 全面豐富的質(zhì)譜研究平臺
擁有高精度質(zhì)譜儀50余臺，包括Orbitrap Astral、timsTOF Pro、Orbitrap Exploris 480、Orbitrap Eclipse、Orbitrap Fusion Lumos、Q Exactive HFX、Q Exactive HF、Q Exactive 等，滿足全球科研用戶全方位需求。
- 關(guān)聯(lián)分析研究經(jīng)驗豐富
具有豐富的蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組的項目執(zhí)行經(jīng)驗，10余年行業(yè)積累；
轉(zhuǎn)錄組和定量蛋白質(zhì)組產(chǎn)品已實現(xiàn)Dr. Tom云平臺交付，科研用戶可自主進行多組學(xué)關(guān)聯(lián)；
具有豐富的關(guān)聯(lián)分析研究經(jīng)驗，在Nature等頂級期刊上自主發(fā)表多篇文獻。
針對人和小鼠，提供轉(zhuǎn)錄因子-靶蛋白調(diào)控分析。轉(zhuǎn)錄因子作為關(guān)鍵的信號調(diào)控分子，響應(yīng)上游信號，進而通過激活或抑制靶基因的表達，參與調(diào)控細胞增殖、分化和應(yīng)答環(huán)境變化等多種生物學(xué)過程。
產(chǎn)品應(yīng)用
- 疾病早期診斷
- 疾病進展監(jiān)測
- 指導(dǎo)分子靶向治療
- 藥物作用評價
- 分子分型研究
- 動植物生長發(fā)育研究
- 植物抗逆性研究
技術(shù)路線
1、Cell繪制人體定量蛋白質(zhì)組圖譜
A?Quantitative?Proteome?Map?of?the?Human?Body.?Cell.?2020.
背景：
確定每個組織中的蛋白質(zhì)水平及其與RNA水平的比較，對了解人類生物學(xué)和疾病以及控制蛋白質(zhì)水平的調(diào)節(jié)過程具有重要意義。
實驗設(shè)計：
采用TMT蛋白質(zhì)定量技術(shù)對GTEx項目（Genotype-Tissue?Expression?Project，該項目從948例死后供者的54個組織中收集樣本，對其轉(zhuǎn)錄組進行了鑒定）中的32個正常人體組織進行研究。
主要結(jié)果：
1）對GTEx項目中32個正常人體組織約12,000個蛋白質(zhì)進行了定量分析。研究鑒定了組織特異性蛋白質(zhì)，并與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較，發(fā)現(xiàn)許多普遍存在的轉(zhuǎn)錄本編碼組織特異性蛋白。
2）RNA和蛋白質(zhì)富集的不一致揭示了潛在的合成和分泌蛋白的作用位點。蛋白質(zhì)的組織特異性分布也提供了對復(fù)雜生物學(xué)事件的深入認知，這些事件需要多個組織的相互作用。
3）研究表明蛋白質(zhì)組織富集信息可以解釋遺傳疾病的表型，而僅靠轉(zhuǎn)錄本信息是無法獲得的，蛋白質(zhì)水平可以為調(diào)控、分泌、代謝和人類疾病提供見解。
圖1 組織間和組織內(nèi)蛋白質(zhì)和RNA的相關(guān)性和一致性分析結(jié)果
2、光滑念珠菌碳代謝重排機制研究
Transcriptomic?and?proteomic?profiling?revealed?reprogramming?of?carbon?metabolism?in?acetate-grown?human?pathogen?Candida?glabrata.?Journal?of?biomedical?science.?2021
背景：
光滑念珠菌能引發(fā)侵襲性念珠菌病，此病發(fā)病率和死亡率均很高。該菌在人體內(nèi)引發(fā)疾病，需要有一套高效的代謝調(diào)控方案。研究表明在缺少葡萄糖的情況下，光滑念珠菌對碳代謝途徑進行了重編排以適應(yīng)人體環(huán)境進而引發(fā)疾病，但具體機制尚不清楚。
實驗設(shè)計：
涉及兩個組別，葡萄糖培養(yǎng)的光滑念珠菌（對照組）和替代碳源醋酸鹽培養(yǎng)的光滑念珠菌（處理組），利用label-free蛋白定量（每組2例生物學(xué)重復(fù)，每例技術(shù)重復(fù)3次）、RNA-Seq（每組3例生物學(xué)重復(fù)）和qRT-PCR（驗證）技術(shù)研究光滑念珠菌在生理相關(guān)替代碳源存在下的基因調(diào)控、分子機制和細胞過程。
主要結(jié)果：
1）轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)顯示，光滑念珠菌的替代碳調(diào)控類似于其他真菌病原體，如白色念珠菌和新型隱球菌，上調(diào)了許多來自乙醛酸循環(huán)和糖異生的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄本。
2）在缺少葡萄糖的情況下，光滑念珠菌的代謝由葡萄糖的分解代謝轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟侵虚g體的合成代謝。即光滑念珠菌主要依賴乙醛酸循環(huán)和糖異生生長來補充葡萄糖中間產(chǎn)物并從醋酸鹽中產(chǎn)生能量，進而提高其在寄主內(nèi)的存活和持久性。
3）本案例采用的方案，后續(xù)可用在臨床菌株及其他可替代碳源的相關(guān)研究中，更深入地了解光滑念珠菌的發(fā)病機制，為疾病的防治奠定基礎(chǔ)。
圖?醋酸鹽培養(yǎng)下光滑念珠菌的乙醛酸循環(huán)和糖異生作用機制
主要關(guān)聯(lián)分析結(jié)果展示
1、樣品選擇
推薦分組：
對照組、處理組；
對照組、不同時期處理組；
對照組、模型組、處理組；
以上基礎(chǔ)上根據(jù)實際項目情況增加其他分組，如不同治療方法/時期、疾病不同階段等。
推薦生物學(xué)重復(fù)：
對于以人或動物模型為樣本的疾病領(lǐng)域研究，推薦每組生物學(xué)重復(fù)30例，至少3例；
對于動植物抗性、育種等領(lǐng)域研究，推薦每組生物學(xué)重復(fù)10例，至少3例；
以上生物學(xué)重復(fù)為推薦數(shù)目，具體請綜合實際項目情況確定。
2、樣品要求
疾病類研究：
各組盡量在性別、年齡、BMI等各方面匹配（其他指標(biāo)根據(jù)研究的具體疾病而定），即各組樣品的性別比例、BMI沒有統(tǒng)計學(xué)差異，盡可能減少變量；
患者診斷明確，患者疾病狀態(tài)和階段要有詳細記錄；
需采集各樣本個體的臨床信息，包括性別/年齡/疾病等各項診斷指標(biāo)；
采集人群需無藥物濫用史，需記錄與疾病相關(guān)的藥物或治療方式；
需獲得知情同意書；
樣品需干冰運輸郵寄。
其他研究（非疾病類研究，如動植物生長發(fā)育研究、抗逆性研究等等）:
如樣品有特殊處理需提前告知，樣品需干冰運輸郵寄。
送樣量，運輸及其他注意事項：
蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組均詳見官網(wǎng)對應(yīng)產(chǎn)品送樣建議。
3、數(shù)據(jù)類型
要求用于關(guān)聯(lián)分析的兩組學(xué)的樣本數(shù)據(jù)一一對應(yīng)（即用于關(guān)聯(lián)分析的兩組學(xué)的樣本來自于相同的生物學(xué)重復(fù)個體），轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以為轉(zhuǎn)錄組/RNA-seq/全長轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)可以為標(biāo)記蛋白定量/Label-free蛋白定量/DIA蛋白定量。
Q1：蛋白質(zhì)組+轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析對用于采集數(shù)據(jù)的樣本有限制嗎？
A1：沒有限制。此關(guān)聯(lián)分析針對蛋白質(zhì)組+轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，滿足條件的數(shù)據(jù)即可進行相應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析，根據(jù)解讀關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果進行數(shù)據(jù)挖掘，因此要求在前期設(shè)計實驗時就要考慮到后面用于關(guān)聯(lián)分析的兩組學(xué)數(shù)據(jù)的樣本來源在生物學(xué)上的相關(guān)性（一般建議用于關(guān)聯(lián)分析的兩組學(xué)數(shù)據(jù)來源于相同的生物學(xué)重復(fù)的個體），單純的數(shù)據(jù)分析本身只討論統(tǒng)計學(xué)的相關(guān)性。
Q2：非模式物種沒有高質(zhì)量的參考基因集，該怎么做關(guān)聯(lián)分析？
A2：理論上我們并不需要參考基因集。我們是根據(jù)中心法則決定的編碼序列一致性來確定蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)錄本的對應(yīng)關(guān)系。具體方法是對蛋白質(zhì)序列和轉(zhuǎn)錄本序列進行blast比對，高于設(shè)定閾值參數(shù)的比對結(jié)果定義為關(guān)聯(lián)上。當(dāng)存在高質(zhì)量的參考基因集并且已有的兩個組學(xué)數(shù)據(jù)分析結(jié)果采用了相同的geneID集合時，我們直接通過geneID匹配來確定關(guān)聯(lián)。
Q3：將蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組進行關(guān)聯(lián)分析時，為什么沒有采用統(tǒng)一GeneID進行匹配關(guān)聯(lián)？
A3：本項目首先用蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的geneID進行匹配關(guān)聯(lián)，如果沒有對應(yīng)的geneID匹配，則用blast比對進行關(guān)聯(lián)。在進行轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)時，新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本在mRNA參考數(shù)據(jù)集中是沒有對應(yīng)的geneID號。如果采用geneID進行關(guān)聯(lián)，新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本無法與數(shù)據(jù)庫中蛋白的geneID進行關(guān)聯(lián)。而采用blast進行同源比對，只要蛋白序列和轉(zhuǎn)錄本序列比對結(jié)果通過設(shè)定閾值，則認為蛋白和轉(zhuǎn)錄本關(guān)聯(lián)上。
Q4：什么是Spearman相關(guān)系數(shù)？Spearman系數(shù)與Pearson系數(shù)有何區(qū)別？
A4：Spearman和Pearson相關(guān)性系數(shù)反應(yīng)的都是兩個變量之間變化趨勢的方向以及程度，其值范圍為-1到+1，0表示兩個變量不相關(guān)，正值表示正相關(guān)，負值表示負相關(guān)，值越大表示相關(guān)性越強。Pearson系數(shù)是協(xié)方差與標(biāo)準(zhǔn)差的比值，它對數(shù)據(jù)是有比較高的要求，第一，由于我們在求pearson相關(guān)性系數(shù)后，通常會用t檢驗之類的方法進行檢驗，而t檢驗是基于數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布的假設(shè)的。所以進行pearson相關(guān)性分析時，實驗數(shù)據(jù)通常假設(shè)是成對的來自于正態(tài)分布的總體。第二，因為pearson相關(guān)性系數(shù)受異常值的影響比較大，所以實驗數(shù)據(jù)之間的差距不能太大。Spearman相關(guān)性系數(shù)，通常也叫Spearman秩相關(guān)系數(shù)?！爸取保梢岳斫獬删褪且环N順序或者排序，那么它就是根據(jù)原始數(shù)據(jù)的排序位置進行求解，這種表征形式就沒有了求pearson相關(guān)性系數(shù)時那些限制。
