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蛋白糖基化、乙酰化、泛素化、乳酸化等
糖基化修飾對蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)的形成具有重要作用，在機體內(nèi)，細胞粘附、分子識別以及信號轉(zhuǎn)導等過程均涉及糖基化蛋白質(zhì)的參與。根據(jù)糖蛋白糖側(cè)鏈連結(jié)方式的不同，蛋白質(zhì)糖基化修飾包括O-連接糖基化(O-linked glycosylation)、N-連接糖基化(N-linked glycosylation)等。N-糖基化是蛋白質(zhì)糖基化修飾中非常普遍和重要的一種修飾，參與了細胞識別、信號轉(zhuǎn)導、黏附、免疫等重要生物過程。
蛋白質(zhì)乙酰化修飾是在乙酰轉(zhuǎn)移酶的作用下，在賴氨酸殘基上添加乙酰基的過程，是一種高度保守的、可逆的翻譯后修飾。從組蛋白與DNA的相互作用，到細胞周期的調(diào)控，神經(jīng)退行性疾病，癌癥的發(fā)生發(fā)展等過程，都有賴氨酸乙酰化過程的廣泛調(diào)控。蛋白質(zhì)乙酰化在臨床方面的應用廣泛，主要在代謝疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，而且去乙酰化酶抑制劑已經(jīng)成為治療心臟病、糖尿病和癌癥等多種疾病的有潛力的試劑。
蛋白質(zhì)泛素化修飾在蛋白質(zhì)降解中的研究最深入。例如，泛素介導的蛋白質(zhì)降解被證明在細胞周期的運轉(zhuǎn)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。最近的研究也發(fā)現(xiàn)泛素化蛋白質(zhì)可能參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路。
乳酸化修飾是乳酸發(fā)揮功能的重要方式，參與糖酵解相關(guān)細胞功能、巨噬細胞極化、血管功能、線粒體、神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控等重要生命活動，可為腫瘤、免疫等領(lǐng)域的研究指引新方向。
技術(shù)路線
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糖基化蛋白質(zhì)組定量分析技術(shù)流程 | 乙酰化/泛素化/乳酸化蛋白質(zhì)組定量分析技術(shù)流程 |
信息分析
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信息分析條款 |
信息分析內(nèi)容 |
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標準信息分析 |
1 鑒定數(shù)量分析 1.1鑒定與定量結(jié)果統(tǒng)計 1.2修飾位點分布分析 1.3韋恩圖分析 2 表達差異分析 2.1差異表達修飾肽段結(jié)果數(shù)量統(tǒng)計 2.2差異表達修飾肽段火山圖分析 2.3差異表達修飾肽段聚類分析 3 功能分析 3.1修飾位點保守基序分析 3.2差異蛋白結(jié)構(gòu)域分析 3.3差異蛋白亞細胞定位分析 3.4差異蛋白GO功能分析 3.5差異蛋白KEGG通路分析 3.6差異蛋白互作網(wǎng)絡分析 |
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定制化信息分析 |
可結(jié)合客戶的需求，協(xié)商確定定制化信息分析服務內(nèi)容。 |
1、通過蛋白質(zhì)組和乙酰化蛋白質(zhì)組研究衣藻動態(tài)光和乙酸依賴的調(diào)節(jié)機制
Dynamic light-and acetate-dependent regulation of the proteome and lysine acetylome of Chlamydomonas. Plant J. 2021
背景：
衣藻是光合作用和生物燃料生產(chǎn)中最重要的微生物之一，因此詳細了解其碳代謝的動態(tài)調(diào)節(jié)對于代謝工程至關(guān)重要。
實驗設(shè)計：
采用二甲基標記技術(shù)定量光養(yǎng)、混養(yǎng)、異養(yǎng)生長條件下生長的衣藻蛋白質(zhì)組和乙酰化蛋白質(zhì)組，研究蛋白質(zhì)乙酰化是否受衣藻中碳源可用性的影響。
主要結(jié)果：
1）共鑒定了5,863個蛋白質(zhì)和1,376個乙酰化位點，差異蛋白主要參與光合作用、脂肪酸代謝和乙醛酸循環(huán)的各種酶。
2）差異乙酰化蛋白質(zhì)主要出現(xiàn)于異養(yǎng)和光養(yǎng)之間，異養(yǎng)條件下，Rubisco大亞基的K175和過氧化物酶體檸檬酸合酶的K99和K340的乙酰化水平特別高。
3）還發(fā)現(xiàn)乙酰化含量與細胞檸檬酸合成酶活性增加及異養(yǎng)條件下已失活的Calvin-Benson循環(huán)相關(guān)。
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圖1 實驗流程圖（左），KEGG結(jié)果圖（右）
2、N-糖蛋白組學分析研究干旱脅迫下小麥幼苗葉片的生長機制
Plasma membrane N-glycoproteome analysis of wheat seedling leaves under drought stress. Int J Biol Macromol. 2021.
背景：
細胞膜蛋白參與許多復雜的生理過程，目前細胞膜蛋白質(zhì)組研究主要集中于人和動物，對植物細胞膜糖蛋白的研究報道很少。小麥是重要的糧食作物，本研究首次對干旱脅迫下小麥幼苗葉片細胞膜糖蛋白進行研究，可識別糖蛋白在干旱脅迫反應中的潛在作用。
實驗設(shè)計：
利用含20%PEG4000的霍格蘭培養(yǎng)液，對三葉期小麥幼苗進行48h、72h和96h的干旱處理，并取葉片，與對照組小麥葉片一起進行膜蛋白提取，之后進行N-糖基化修飾蛋白質(zhì)組分析。
圖2 干旱處理實驗設(shè)計
主要結(jié)果：
1）共鑒定出414個糖基化位點，對應407個糖肽和312個糖蛋白，其中173個細胞膜蛋白具有215個N糖基化位點受干旱脅迫顯著變化。
2）功能富集分析表明，差異糖基化蛋白參與細胞外信號接收和轉(zhuǎn)導以及植物細胞壁重塑的蛋白激酶活性密切相關(guān)。
3）Motif分表明，79.5%motif位于蛋白表面的無規(guī)螺旋和柔性區(qū)域，該通過降低蛋白質(zhì)的柔韌性可促進蛋白質(zhì)的糖基化修飾，提高蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
圖3 糖基化蛋白鑒定結(jié)果
1、項目概述及質(zhì)控分析
基于乙酰化蛋白質(zhì)組定量分析結(jié)果，分別從乙酰化肽段、（蛋白）乙酰化位點和乙酰化蛋白（乙酰化肽段對應的蛋白）三個層面統(tǒng)計整體項目以及各樣本的鑒定情況。
分別從組內(nèi)變異系數(shù)，主成分分析以及樣本定量相關(guān)性等方面來評估數(shù)據(jù)的質(zhì)量。當樣本數(shù)目較多時，會在連續(xù)上機樣本中間斷的插入QC樣本（QC樣本一般為所有樣本的混樣），從而能在以下質(zhì)控分析中評估實驗條件，以便確保實驗的穩(wěn)定性和重復性。
圖1 CV分布圖
2、乙酰化肽段定量及差異乙酰化蛋白功能注釋
通過差異倍數(shù)大于1.5或小于2/3，同時滿足統(tǒng)計檢驗P-value值小于0.05，篩選顯著性差異乙酰化肽段。
進一步對差異乙酰化肽段對應的蛋白質(zhì)，包括GO、COG/KOG和KEGG pathway富集等多種功能注釋富集分析。
圖2 乙酰化肽段定量及差異乙酰化蛋白富集分析
左圖為乙酰化肽段定量分析火山圖，橫軸為肽段定量值（log2化），縱軸為統(tǒng)計檢驗的P-value（-log化），分布在該火山圖左上右上兩區(qū)域的肽段為顯著差異肽段；中圖為差異乙酰化蛋白GO富集分析圖，右圖為差異乙酰化蛋白KEGG?Pathway富集分析氣泡圖。
表1 乙酰化，泛素化，糖基化送樣要求
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樣品類型 |
送樣量 |
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乙酰化 |
泛素化 |
N-糖基化 |
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動物組織類 |
常規(guī)動物組織（腦、心、肝、脾、肺、腎、肌肉、皮膚等） |
75mg-2g |
75mg-2g |
30mg-1g |
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軟體動物（血吸蟲、旋毛蟲等） |
75mg-2g |
70mg-2g |
30mg-1g |
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動物堅韌組織-軟骨 |
600mg-5g |
400mg-5g |
200mg-1g |
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動物堅韌組織-毛發(fā) |
75mg-2g |
100mg-2g |
30mg-1g |
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植物組織類 |
柔軟組織（木本植物的葉、花等，草本科植物，藻類，蕨類植物，大型真菌等） |
≥3g |
≥3g |
100mg-1g |
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木本科植物的樹根、樹皮、樹枝等 |
5g-50g |
5g-50g |
3g-25g |
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果實、種子 |
1g-5g |
1g-5g |
0.5g-2g |
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花粉 |
≥3g |
≥3g |
500mg-1g |
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微生物類 |
菌類 |
150mg-2g |
150mg-2g |
50mg-2g |
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細胞樣品 |
懸浮/貼壁培養(yǎng)細胞 |
3×107-5×108 |
2×107-5×108 |
1.5-5×107 |
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蛋白液 |
總蛋白 |
10mg，最低3mg |
10mg，最低3mg |
1.5mg，最低800μg |
表2 乳酸化送樣要求
樣品類型 | 送樣量 | |
動物組織類 | 常規(guī)動物組織（心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺等） | ≥100mg |
植物組織類 | 植物根、莖、葉、果實等 | ≥1g |
微生物類 | 細菌、真菌等 | 細菌菌體 ≥200mg 真菌菌體 ≥1.5g |
細胞樣品 | 懸浮/貼壁培養(yǎng)細胞 | ≥3×107 |
Q1：修飾蛋白質(zhì)組學的研究價值主要在于？
A1：很多生物生命活動的發(fā)生和改變，不僅與蛋白的表達量相關(guān)，也可能與蛋白的修飾狀態(tài)相關(guān)，常規(guī)蛋白質(zhì)組學主要是在蛋白表達量層面對生物樣本進行研究，而修飾蛋白質(zhì)組學更關(guān)注于蛋白的修飾水平，兩種技術(shù)聯(lián)用，可以從表達量和修飾水平兩個層面進行蛋白質(zhì)組學研究；相較于常見的轉(zhuǎn)錄組 + 蛋白質(zhì)組從而在中心法則的不同水平研究同一個問題-蛋白表達量，常規(guī) + 修飾蛋白質(zhì)組學提供了科研的新思路和新選擇。
Q2：泛素化位點是如何確定的？
A2：一種特定的翻譯后修飾通常會作用于一定的氨基酸，經(jīng)修飾后，這一類氨基酸會增加相同的分子量，如，在胰蛋白酶消化泛素化蛋白后，泛素依然附著在靶蛋白上，從而產(chǎn)生114Da的質(zhì)量位移，基于質(zhì)量偏移的理論，利用生物信息學方法可以分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定泛素化翻譯后修飾。
Q3：能否做糖鏈分析及O糖等其他糖型的位點分析？
A3：目前暫不提供糖鏈結(jié)構(gòu)分析，只是針對N-糖基化蛋白相關(guān)的分析，確定蛋白修飾位點；其他糖型暫不能進行分析，在實驗過程中采用PNGase F酶進行脫糖步驟，而PNGase F酶只能夠切除N-糖鏈的糖基，所以在質(zhì)譜分析時只能對N糖進行檢測。
