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N-連接完整糖肽蛋白質組
糖基化作為一種重要的翻譯后修飾，廣泛存在于細胞膜表面與體液中，哺乳動物體內約50%的蛋白都被糖基化修飾。N糖基化被認為參與到細胞間信號識別、轉導、調控、蛋白質折疊、定位、空間構象穩定以及免疫調控等生物學功能中，并參與到腫瘤等疾病的發生與發展。近年來，越來越多的研究表明基于位點特異性水平的蛋白質N-連接糖基化的精確表征對于許多疾病的新診斷標志物和潛在治療靶點的發現，以及針對各種病毒的有效疫苗的開發都具有很大價值。
N糖基化修飾主要發生于 N-X-S/T（天冬酰胺-X-絲氨酸/蘇氨酸，XX可以是除脯氨酸以外的任意氨基酸）的特定氨基酸基序上，N糖鏈主要由與天冬酰胺上相連的五糖核心和還原末端的分支天線組成，五糖核心是由兩個N-乙酰葡糖胺與三個甘露糖組成的N糖鏈共有結構，五糖核心也會進一步被一些單糖修飾：被核心巖藻糖修飾的五糖核心，平分型五糖核心，被核心巖藻糖修飾的平分型五糖核心。根據五糖核心外圍生長的天線類型，糖鏈又可被分為三種糖型，高甘露糖型——糖鏈兩側的分支僅由甘露糖組成，復雜型——糖鏈兩側的分支由N-乙酰葡糖胺、半乳糖、唾液酸與巖藻糖等組成，混合型——糖鏈兩側的分支一側為高甘露糖分支一側為復雜分支。
傳統的N-連接糖蛋白質組定量分析去除了糖鏈，只對去糖基化多肽進行分析，缺失了復雜的糖鏈中蘊藏的遺傳信息。基于完整糖肽的方法對N-連接糖蛋白質進行研究，可以同時獲得糖鏈結構、糖基化修飾肽段及糖鏈和糖基化位點的對應關系等信息，為蛋白糖基化研究提供更全面的解決方案。通過標記定量技術可以在一次實驗中對多達16個糖蛋白樣品進行定量比較，該定量方法幾乎可以對任何蛋白樣品進行定量分析，具有高定量精度的特點，目前已經越來越廣泛地應用于定量蛋白質組學領域。
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產品名稱 |
產品優勢 |
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N-連接完整糖肽鑒定 |
真結構：StrucGP軟件實現真正意義上的糖鏈結構解析。 超全面：同時獲得糖鏈結構、糖肽及糖鏈和糖基化位點的對應關系。 高深度：常規全譜鑒定5,000+，超深度檢測可達14,000+；定量鑒定糖肽2,700+。 高通量：TMT/IBT標記定量可同時對多至16個樣本進行檢測。 |
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N-連接完整糖肽IBT/TMT定量 |
（1）N-連接完整糖肽鑒定
N-連接完整糖肽鑒定分析從蛋白質的提取開始，經過酶解、混合陰離子交換固相萃取柱（Max柱）富集，之后經過高效液相分離，在質譜上機分析時采用HCD 20.00-33.00的階梯能量碎裂模式。StrucGP首先在包含氧鎓離子的高能量譜圖中對N-連接完整糖肽中的多肽鏈序列進行鑒定，隨后在低能量譜圖中通過模塊化鑒定策略對N-連接完整糖肽的核心結構、糖型與分支結構進行解析，進而完成對N-連接完整糖肽的鑒定。
圖1 N-連接完整糖肽鑒定技術流程
（2）N-連接完整糖肽IBT/TMT定量
IBT或TMT定量方法可以在一次串聯質譜實驗中同時比較多至16/18個樣品中的蛋白的相對含量，分別為蛋白提取、酶解、標記、混合糖肽富集、高效液相分離和液相串聯質譜分析。在一級質譜時，平衡基團可以確保無論用哪種報告離子標記肽段，都顯示為相同的質荷比值。在二級質譜時，平衡基團發生中性丟失，報告離子的強度可以反映肽段的相對豐度值，其余峰為肽段碎裂后的子離子峰，用于后續鑒定。
圖2 N-連接完整糖肽定量技術流程
信息分析內容：
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信息分析條款 |
信息分析內容 |
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標準信息分析 |
1 N-連接完整糖肽鑒定結果 1.1鑒定結果統計 1.2 糖結構與位點熱圖 1.3 糖基化位點數量分布圖 1.4 Motif圖 1.5 特殊單糖分布圖 1.6 糖型、糖核心和分支的拆解 1.7 Top 10糖鏈分布圖 1.8 高分布糖鏈譜圖標注 2 N-連接完整糖肽定量結果 2.1 差異表達糖蛋白火山圖 2.2 聚類熱圖 3 糖蛋白功能分析 3.1 GO注釋 3.2 KEGG注釋 3.3 蛋白互作分析 3.4 亞細胞定位 |
1、新型冠狀病毒刺突蛋白的結構和位點特異性N-糖基化修飾研究
Structural-and Site-Specific N-Glycosylation Characterization of COVID-19 Virus Spike with StrucGP. Anal Chem.2022
實驗背景：
刺突蛋白（S）在新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）進入宿主細胞以及免疫逃避過程中起著關鍵作用，本研究利用結構和位點特異性N-連接糖蛋白組學測序算法StrucGP，在位點特異性水平上提供了S蛋白的N-糖基化修飾結構。
實驗設計：
利用N-連接完整糖肽解析軟件StrucGP對SARS-CoV-2病毒S蛋白每個糖基化位點上修飾的糖鏈結構進行解析。
主要結果：
1）提供了包含糖鏈結構信息的新冠S蛋白糖基化修飾圖譜。特殊/不常見的糖鏈結構以及糖鏈結構異構體在20個糖基化位點上被精確解析；
2）S蛋白的位點特異性糖鏈結構信息可為進一步的糖基化功能研究提供堅實的基礎。
圖1 COVID-19病毒刺突蛋白三聚體的整體糖基化特征
2、糖蛋白組學分析顯示核心巖藻糖促進上皮-間充質轉化（EMT）
Site-specific glycoproteomic analysis revealing increased core-fucosylation on FOLR1 enhances folate uptake capacity of HCC cells to promote EMT. Theranostics. 2021
實驗背景：
上皮-間充質轉化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)被認為是包括肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）在內的許多癌癥向高侵襲轉移的重要一步，但EMT促進機制尚不清楚。
實驗設計：
完整糖蛋白組學方法系統研究了HGF/TGF-β1誘導肝癌細胞EMT過程中位點特異性糖基化的動態變化，再利用各種分子生物學方法進一步證實了EMT相關糖蛋白和位點特異性聚糖的可能作用。
主要結果：
利用質譜分析的方法，SMMC-7721和HepG2細胞系共鑒定了2306個完整糖肽，通過StrucGP分析軟件發現核心巖藻糖在復雜N-聚糖中所占比例最大。通過對完整糖肽的定量分析發現大部分來自葉酸受體α (FOLR1)的核心巖藻糖型完整糖肽在三個HGF處理的細胞系中上調。同樣，在TGF-β1處理的SMMC-7721和Hep3B細胞中，FOLR1的核心巖藻糖水平上調。利用分子生物學方法，進一步證明FUT8是HGF/TGF-β1誘導的EMT的驅動因子。FUT8的沉默降低了核心巖藻糖水平，部分阻斷了HGF誘導的EMT的進展。最后，本研究證實了FOLR1，特別是糖苷Asn-201位點的核心巖藻糖水平正調控葉酸的細胞攝取能力，而葉酸的增強攝取可以促進HCC細胞的EMT。
圖2 EMT過程中肝癌細胞系的動態定點糖基化和蛋白質組分析的工作流程圖
1、質控分析
PCA圖
2、N-連接完整糖肽鑒定結果
3、N-連接完整糖肽定量及功能分析結果
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樣品類型 |
送樣建議量 |
最低送樣量 |
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動物組織類 |
常規動物組織（腦、心、肝、脾、肺、腎、肌肉、皮膚等） |
100mg |
50mg |
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動物堅韌組織-軟骨
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100mg |
50mg |
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動物堅韌組織-毛發
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100mg |
50mg |
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細胞樣本 |
懸浮/貼壁培養細胞
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1*108 |
5*107 |
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液體類 |
血清、血漿 |
500μL |
300μL |
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體液 |
2mL |
1mL |
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蛋白液 |
總蛋白 |
5mg |
3mg |
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單個蛋白（IP、CO-IP等純化獲得的蛋白液） |
20ug |
20ug |
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Q1：為何使用strucGP軟件進行完整糖肽的鑒定？
A1：strucGP發表于Nature Methods期刊上（IF=47.990），是目前完整糖肽鑒定軟件中影響因子最高的軟件。strucGP可以對糖鏈的結構進行解析，精確的糖鏈結構信息可以指導后續驗證實驗中敲低或過表達的糖基轉移酶與糖苷酶的選擇，提高驗證實驗成功的概率，并為生物學事件中深度的機理與機制挖掘提供全新的分析維度。
Q2：能夠進行樣品內不同蛋白豐度比較嗎？
A2：不可以，目前標記定量技術適合比較同一個蛋白在不同樣品的相對量比較。
Q3:糖基化IBT/TMT中差異蛋白可以給出差異糖基化蛋白的上下調信息嗎？
A3：糖基化標記定量是對肽段進行定量的。因為同一個糖基化蛋白的不同修飾位點的表達情況可能是不一致的，無法對糖基化蛋白進行定量，只能確認是否是差異糖基化蛋白。無法確認該蛋白具體是上調還是下調。
