- 首頁 ＞ 長讀長人全基因組重測序
長讀長人全基因組重測序
人類基因組變異的完整圖對于深入了解遺傳特征、助力疾病精準(zhǔn)研究非常重要。雖然短讀長測序可準(zhǔn)確地檢測SNP、InDel小的變異類型，但對CNV和SV的檢測靈敏度有限。近年來長讀長測序已被廣泛用于人類基因組研究，其能夠有效解析復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)，包括高度重復(fù)的基因區(qū)域和基因組結(jié)構(gòu)變異，為尋找疾病相關(guān)變異提供了更全面的基因組視角，其高準(zhǔn)確性也使得它能夠發(fā)現(xiàn)短讀長測序技術(shù)可能錯過的罕見變異，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究提供更精確的基因變異信息。
結(jié)合華大自主研發(fā)長讀長納米孔測序技術(shù)CycloneSEQTM和短讀長高通量DNBSEQTM測序技術(shù)，華大科技推出長+短WGS整體解決方案，可為科研人員提供更好基于長讀長和短讀長測序平臺的全流程服務(wù)解決方案。
產(chǎn)品優(yōu)勢
1. 國產(chǎn)自主 采用國產(chǎn)華大自主長讀長（CycloneSEQ）及短讀長（DNBSEQ）測序平臺，實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)全面替代。
2. 高效精準(zhǔn) 長讀長+短讀長技術(shù)融合，無偏向的覆蓋基因組區(qū)域，精準(zhǔn)解析基因組全變異。
3. 高性價(jià)比 長（15X）+短（30X），在SNP和InDel表現(xiàn)上均達(dá)到所有純長讀長平臺30X水平，InDel表現(xiàn)優(yōu)勢顯著，SV表現(xiàn)基本持平。
4. 全面覆蓋 提供從低深度到高深度，短讀長到長讀長的人全基因組測序整體解決方案。
5. 經(jīng)驗(yàn)豐富 在大規(guī)模人群隊(duì)列研究領(lǐng)域具有深厚的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，主導(dǎo)或參與多個國家或地區(qū)級重大項(xiàng)目，包括HGP 1%、千人基因組、天壇萬例、瑞金ChinaMap萬例、華西十萬例等。
產(chǎn)品應(yīng)用
復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異
罕見病研究
癌癥研究
人群隊(duì)列研究
遺傳多樣性研究
藥物研究等
技術(shù)路線
長讀長和短讀長測序的下機(jī)數(shù)據(jù)，獲得到高質(zhì)量的reads，將reads分別比對到參考基因組上，對比對結(jié)果進(jìn)行排序得到的文件聯(lián)合用于后續(xù)全變異檢測，最后對變異結(jié)果進(jìn)行注釋及統(tǒng)計(jì)。
人群隊(duì)列研究
Structural variation in 1,019 diverse humans based on long-read sequencing
基于長讀長測序的 1,019 個不同人類的結(jié)構(gòu)變異
期刊名稱：Nature
發(fā)表日期：2025年7月23日
影響因子：48.5
DOI：10.1038/s41586-025-09290-7
材料：來自"千人基因組計(jì)劃"26個種族的1,019人。
測序策略：ONT 平臺，中位覆蓋度16.9×，中位讀長N50為20.3 kb。
主要成果：
（1）構(gòu)建最全面的SV圖譜：鑒定超過100,000個雙等位SVs和300,000個多等位VNTRs，顯著優(yōu)于短讀長測序（插入和缺失檢測效率分別提高10倍和40%）。
（2）揭示SV形成機(jī)制：發(fā)現(xiàn)878例轉(zhuǎn)座子（L1/SVA）介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，其中8q21.11位點(diǎn)存在獨(dú)特的5'轉(zhuǎn)導(dǎo)偏好性；首次在群體水平識別1,849例倒位變異。
（3）醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值：該圖譜在270個臨床相關(guān)位點(diǎn)的分型準(zhǔn)確性顯著提升，可過濾54%的候選SVs。
總結(jié)：該研究繪制了涵蓋26個祖先人群中常見和罕見SV圖譜。與gnomAD相比，該圖譜數(shù)據(jù)中有50.9%的插入、14.5%的缺失尚未被報(bào)道，強(qiáng)調(diào)了長讀長測序在推進(jìn)SV表征方面的價(jià)值。
圖1 取樣范圍和實(shí)驗(yàn)方法
遺傳病研究
案例一：單基因疾病研究
Long read sequencing enhances pathogenic and novel variation discovery in patients with rare diseases
長讀長測序增強(qiáng)罕見病患者的致病性和新變異的發(fā)現(xiàn)
期刊名稱：Nature Communications
發(fā)表日期：2025年3月14日
影響因子：15.7
DOI：10.1038/s41467-025-57695-9
材料：51名高度疑似單基因疾病患者的DNA（實(shí)驗(yàn)組）和17例已知有基因組或甲基化畸變的DNA（對照組）。
測序策略：使用ONT平臺測序（30×覆蓋度，平均N50為12 kb）。
分析方法：重點(diǎn)篩選破壞致病基因或關(guān)鍵位點(diǎn)的變異。LRS結(jié)合自主研發(fā)的“Epimarker”工具，用于檢測甲基化標(biāo)記。
主要成果：
（1）該研究將罕見病診斷率提升10%，首次發(fā)現(xiàn)脊髓性肌萎縮癥（SMA）的特異性甲基化標(biāo)簽。
（2）LRS可高效檢測傳統(tǒng)技術(shù)難以識別的變異：在51例未確診患者中，LRS新診斷出5例（10%），包括2q11.2缺失綜合征和SLC38A8基因突變等病例
圖2 實(shí)驗(yàn)工具方法與樣本選擇
案例二：遺傳病研究
- 研究疾?。哼z傳性血小板減少癥2（THC2）
- WGS和WES測序方法無法確定該家族的發(fā)病原因。
- 使用長讀長全基因組測序，確定了一個涉及配對重復(fù)倒位的大型復(fù)雜結(jié)構(gòu)變體。
- 該結(jié)構(gòu)變異導(dǎo)致致病性功能獲得性WAC - ANKRD26融合轉(zhuǎn)錄本。
圖3 研究流程與內(nèi)容
罕見病研究
The implementation of genome sequencing in rare genetic diseases diagnosis: a pilot study from the Hong Kong genome project
基因組測序在罕見遺傳病診斷中的應(yīng)用：香港基因組計(jì)劃的先導(dǎo)研究
期刊名稱：Lancet Regional Health-western Pacific
日期：2025年1月28日
影響因子：8.1
DOI：10.1016/j.lanwpc.2025.101473
材料：來自520個具有廣泛罕見遺傳病譜系的家族的1264名個體，其中94%為中國人。所有樣本均進(jìn)行了短讀長測序 (srGS)，其中21例疑難樣本額外接受了長讀長測序 (lrGS)。
測序策略：短讀長測序（平均深度39×）， ONT長讀長測序（30×）。
主要成果：
（1）總體診斷率達(dá)28%（146/520），其中srGS單獨(dú)貢獻(xiàn)24%，lrGS進(jìn)一步提升4%。成人患者診斷率顯著高于兒童（32% vs 24%），且未接受過基因檢測的患者診斷率更高（37% vs 23%）。
（2）約三分之一變異為首次報(bào)道，填補(bǔ)了東亞人群基因組數(shù)據(jù)的空白。此外，測序技術(shù)平均縮短了15年的診斷歷程，并在77%的確診病例中改變了臨床管理策略，如精準(zhǔn)用藥調(diào)整或家系篩查。
圖4 診斷流程與案例說明
癌癥研究
案例一：Real-time genomic characterization of pediatric acute leukemia using adaptive sampling
使用自適應(yīng)采樣實(shí)時表征兒童急性白血病的基因組
期刊名稱：Leukemia
發(fā)表日期：2025年3月24日
影響因子：13.4
DOI：10.1038/s41375-025-02565-y
材料：57例不同基因亞型的兒童急性白血病病例的外周血或骨髓（含39例回顧性樣本和18例實(shí)時診斷樣本）。
測序策略：ONT 測序，平均獲得了12X的全基因組覆蓋度和 86X的目標(biāo)基因覆蓋度。
分析方法：通過自適應(yīng)取樣技術(shù)選擇性富集59個白血病相關(guān)融合基因靶點(diǎn)。該方法對染色體非整倍體的檢測靈敏度達(dá)96%，融合基因檢出率100%，且平均9小時內(nèi)即可完成。
主要成果：該技術(shù)不僅重現(xiàn)了傳統(tǒng)檢測（核型分析、FISH）的所有結(jié)果，還額外檢出5例臨床漏診的融合事件（如DUX4::IGH），并成功識別FLT3-ITD等藥物基因組變異。
圖5 實(shí)驗(yàn)與分析內(nèi)容
案例二：腫瘤研究
Whole-genome sequencing with long reads reveals complex structure and origin of structural variation in human genetic variations and somatic mutations in cancer5.
2021年4月Genome Medicine發(fā)表了此文章。本研究對前人研究過得DNA樣本進(jìn)行了重新測序，證明了長讀長測序技術(shù)在分析人類多態(tài)性和體細(xì)胞突變方面的優(yōu)勢，揭示了癌癥基因組復(fù)雜結(jié)構(gòu)與變異的來源，為未來的遺傳學(xué)研究做出了貢獻(xiàn)。該研究利用長讀長測序技術(shù)，對ICGC（International Cancer Genome Consortium，國際癌癥基因組聯(lián)合會）已報(bào)道的11例日本肝癌患者進(jìn)行了全基因組測序，并與ICGC測序的正常樣本進(jìn)行了匹配，將測序數(shù)據(jù)與參考基因組GRCH38進(jìn)行比對，獲得高質(zhì)量SV。由于測序reads較長，大多數(shù)reads被唯一map到參考基因組，本研究中長讀長檢測到的SV數(shù)量是短讀長的1.6倍，表明長讀長測序在檢測SV方面更有效。對鑒定到的肝癌患者的體細(xì)胞SV進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)長讀長測序技術(shù)可以檢測到大量的體細(xì)胞SV與病毒整合，與鑒定到的生殖細(xì)胞SV比較后發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞與生殖細(xì)胞中的SV存在差異。
圖6 肝癌中的體細(xì)胞結(jié)構(gòu)變異
SNP檢測準(zhǔn)確度和靈敏度
從測試結(jié)果中看到SNP（CycloneSEQ 15X + DNBSEQ 30X）F1 Score（99.63%） 即可達(dá)到PB（30X）、ONT（30X）、CycloneSEQ（30X）水平，優(yōu)于DNBSEQ（30X）。
圖 1 SNP檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度
InDel檢測準(zhǔn)確度和靈敏度
從測試結(jié)果中看到InDel（CycloneSEQ 15X + DNBSEQ 30X）F1 Score （99.37%）即可達(dá)到PB（30X）水平，遠(yuǎn)超于ONT（30X）、CycloneSEQ（30X），優(yōu)于DNBSEQ（30X）。
圖 2 InDel檢測靈敏度和準(zhǔn)確度
SV檢測準(zhǔn)確度和靈敏度
從測試結(jié)果看到，SV（CycloneSEQ 15X + DNBSEQ 30X）F1 Score（93.83%）和PB（30X）、ONT（30X）、CycloneSEQ（30X）基本持平，遠(yuǎn)優(yōu)于DNBSEQ（30X）。
圖 3 SV檢測靈敏度和準(zhǔn)確度
飽和度分析
分別截取10X,15X,20X,25X,30X,35X,40X的Cyclone數(shù)據(jù)來做深度梯度飽和度分析。從實(shí)測數(shù)據(jù)中可以看到，長讀長Cyclone數(shù)據(jù)達(dá)到15X時F1值出現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)折，且F值達(dá)到93%以上，因此Cyclone（15X）+DNBSEQ（30X）是首選性價(jià)比較高的推薦組合方案，當(dāng)Cyclone數(shù)據(jù)達(dá)到30X時，F(xiàn)1已經(jīng)超高95%，追求更卓越質(zhì)量的客戶首選。
圖 4 不同深度SV檢測結(jié)果（長+短方案）
*上述分析結(jié)果由華大信息分析流程所得，測試結(jié)果不代表交付指標(biāo)，最終解釋權(quán)歸深圳華大基因股份有限公司所有
DNA送樣建議
樣本類型 | 文庫類型 | 總量 | OD值 | 樣品純度 |
Genomic DNA | PacBio HiFi CCS | m≥7μg，c≥60ng/μL | OD260/280：1.6-2.2 OD260/230：1.6-2.5 | 無RNA、蛋白質(zhì)或鹽離子污染； 無色透明；無粘性。 |
Genomic DNA | Cyclone normal long | m≥12μg，c≥90ng/μL | OD260/280=1.8-2.0 OD260/230=2.0-2.2 |
組織送樣建議
樣本類型 | 樣品純度 | |
人全血 | 新鮮血液樣本（推薦） | 3-6 mL |
冷凍血液樣本 | ≥6mL | |
無紅細(xì)胞的血細(xì)胞（白細(xì)胞或PBMC） | 6-10mL 收集的全血 | |
細(xì)胞 | ≥5×108 | |
新鮮組織 | 組織（干重）≥1g | |
Q1: 如果自己提取，長片段DNA應(yīng)該如何保存？
對于提取后的長片段gDNA樣本，4°C可保存半年，-20°C可保存一年，但-20°C保存建議只進(jìn)行一次凍融，反復(fù)凍融會造成樣本降解，樣本 DNA 不能進(jìn)行震蕩或劇烈混勻操作，以免長片段DNA斷裂。我們不推薦您送DNA樣品，因?yàn)镈NA的長度直接影響了phasing的長度。另外，DNA樣品在運(yùn)輸途中會有損傷。
Q2：為什么要用長讀長檢測SV？
結(jié)構(gòu)變體（SV），包括缺失，插入，重復(fù)和倒位，占個體人類基因組中大多數(shù)變異的堿基對。許多研究中已經(jīng)牽涉到人類健康的SV與相關(guān)表型有著直接或著間接的關(guān)系。因此，鑒定遺傳變異并推斷其功能影響是人類遺傳學(xué)研究中最重要的問題之一。然而，因?yàn)镾V易于在重復(fù)區(qū)域中出現(xiàn)并且內(nèi)部SV結(jié)構(gòu)可能出現(xiàn)的復(fù)雜性導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)這些變體和基因分型變得具有挑戰(zhàn)性。因此，需要長讀長測序技術(shù)對SV結(jié)構(gòu)進(jìn)行新的探索，并對人類種群SV的檢測進(jìn)行分析，來理解與SV相關(guān)的疾病研究。
Q3： 如何選擇合適的測序深度？
對于不同的研究目的和預(yù)算限制，選擇合適的測序深度至關(guān)重要。一般來說，15X的長讀長測序結(jié)合30X的短讀長測序可以達(dá)到較好的效果。增加測序深度可以提高變異檢測的靈敏度和精確度，但同時也會增加成本。因此，根據(jù)具體的研究需求來平衡測序深度與成本之間的關(guān)系是關(guān)鍵。
