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時(shí)空轉(zhuǎn)錄組FF
時(shí)空轉(zhuǎn)錄組FF產(chǎn)品服務(wù)，是一項(xiàng)基于Sereo-seq技術(shù)的高精度空間定位轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)解決方案。該服務(wù)利用帶有空間坐標(biāo)信息的Poly T捕獲探針芯片，對新鮮冷凍組織（Fresh Frozen, FF）切片中的mRNA進(jìn)行原位捕獲，結(jié)合DNBSEQ?高通量測序平臺，通過對帶有空間條形碼（Coordinate lD, CID）的cDNA進(jìn)行測序和分析，精準(zhǔn)地將每個(gè)轉(zhuǎn)錄本映射回其在組織中的原始空間位置，實(shí)現(xiàn)基于空間位置的單細(xì)胞水平分析。
此項(xiàng)技術(shù)的核心優(yōu)勢在于其納米級分辨率與厘米級全景視場的獨(dú)特結(jié)合，能夠在組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞及分子四個(gè)尺度上，同步進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組解析。不僅實(shí)現(xiàn)了對基因表達(dá)空間模式的高清描繪，更為深入探究細(xì)胞基因表達(dá)、形態(tài)特征與其所處局部微環(huán)境之間的復(fù)雜相互作用，奠定了強(qiáng)大而精確的研究基礎(chǔ)。
應(yīng)用領(lǐng)域
- 疾病研究：細(xì)胞異質(zhì)性及其空間結(jié)構(gòu)對疾病的發(fā)生發(fā)展和治療至關(guān)重要
- 發(fā)育研究：在空間上解析細(xì)胞類型及其相互作用是發(fā)育研究的基礎(chǔ)
- 器官研究：細(xì)胞類型及其空間結(jié)構(gòu)是研究器官功能及相關(guān)疾病的重要基礎(chǔ)
- 演化研究：利用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)理解器官在細(xì)胞水平的進(jìn)化過程
產(chǎn)品優(yōu)勢
1. 更高 · 分辨率
Stereo-seq技術(shù)將認(rèn)識生命空間表達(dá)的分辨率提高到500 nm的亞細(xì)胞層級；可以通過圖像識別細(xì)胞核位置，并結(jié)合算法實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞及分子信息的空間定位和檢測；也可通過binning的方式，識別組織中的不同功能區(qū)域。
2. 更大 · 全景視場
Stereo-seq的常規(guī)芯片大小為1 cm*1cm，最大可拓展至13 cm*13 cm，多尺寸時(shí)空芯片方案能極大地提升捕獲面積利用率。
實(shí)驗(yàn)流程
1. 樣品制備：對OCT包埋組織，進(jìn)行切片及 RNA 質(zhì)量評估后，再進(jìn)行組織切片，將合格切片貼到時(shí)空芯片；
2. 組織透化：將鋪貼到芯片上的組織進(jìn)行切片固定和滲透。時(shí)空芯片上布置有空間捕獲探針，能與組織細(xì)胞釋放的mRNA 分子結(jié)合，從而在芯片上抓取目標(biāo)樣本組織細(xì)胞的 mRNA 分子，并合成cDNA；
3. 文庫制備及測序：cDNA合成后構(gòu)建測序文庫，用華大自主研發(fā)的國產(chǎn)化超高通量的測序儀完成測序；
4. 數(shù)據(jù)分析：針對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，并完成全套分析，最終得到目標(biāo)樣本組織細(xì)胞在空間位置上表達(dá)的基因信息。
項(xiàng)目執(zhí)行周期
4個(gè)樣品標(biāo)準(zhǔn)流程（建庫，測序和SAW分析）的正常周期約為25個(gè)工作日；但由于前期樣品處理（切片、染色、透化）步驟需反復(fù)溝通該周期不會記入項(xiàng)目執(zhí)行周期。
測序建議
- 測序平臺：DNBSEQ平臺
- 測序讀長：PE100
- 數(shù)據(jù)量推薦：1cm x 1cm芯片正式實(shí)驗(yàn)執(zhí)行樣品建議交付數(shù)據(jù)：2G raw reads; 0.5cm x 0.5cm 芯片正式實(shí)驗(yàn)執(zhí)行樣品建議交付數(shù)據(jù)：1G raw reads;
- Q30>80%
【發(fā)育研究】
案例一? Stereo-seq繪制小鼠胚胎發(fā)育時(shí)空圖譜?
文章題目：Spatiotemporal?transcriptomic?atlas?of?mouse?organogenesis?using?DNA?nanoball-patterned?arrays
發(fā)表期刊：Cell
影響因子：66.850
發(fā)表時(shí)間：2022年5月4日
Dol:10.1016/i.cell.2022.04.003?
研究成果：
將DNA納米球模式陣列與原位RNA捕獲相結(jié)合，開發(fā)了時(shí)空組學(xué)技術(shù)?Stereo-seq，以期深入了解發(fā)育中組織（如背側(cè)中腦）的空間細(xì)胞異質(zhì)性和細(xì)胞命運(yùn)分化的分子基礎(chǔ)。
1. 利用 Stereo-seq 技術(shù)，描述了小鼠胚胎發(fā)育中晚期的器官發(fā)育基因的空間表達(dá)模式以及器官發(fā)育的軌跡，構(gòu)建了小鼠器官發(fā)生時(shí)空轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫 (MOSTA,https://db.cngb.org/stomics/mosta/)；
2. 獲取了E16.5小鼠全胚胎具有空間位置的單細(xì)胞時(shí)空轉(zhuǎn)錄組信息，并在同一張切片上鑒定了4種上皮細(xì)胞亞型和6種成骨細(xì)胞亞型的空間分布情況，描述了前腦的抑制性神經(jīng)元從內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)降起至皮層的遷移軌跡；
3. 利用 Stereo-seq 構(gòu)建的小鼠中晚期的胚胎時(shí)空轉(zhuǎn)錄組圖譜,描述了人類發(fā)育缺陷相關(guān)?1,959?個(gè)基因在小鼠胚胎中表達(dá)模式。
【再生研究】
案例二? Stereo-seq鑒定端腦再生過程中的重要神經(jīng)干細(xì)胞亞型
文章題目：Single-cell?Stereo-seq?reveals?induced?progenitor?cells?involved?in?axolotl?brain?regeneration
發(fā)表期刊：Science
發(fā)表時(shí)間：2022年9月2日
影響因子：63.714
DOl: 10.1126/science.abp9444
研究成果：
應(yīng)用?Stereo-seq 技術(shù)首次構(gòu)建了蛛端腦結(jié)構(gòu)，繪制了蝶端腦整個(gè)發(fā)育和損傷再生過程中原位單細(xì)胞分辨率的基因表達(dá)圖譜和細(xì)胞空間動態(tài)變化圖譜，為研究腦再生的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
1. 有一種神經(jīng)干細(xì)胞亞型在蝶端腦再生過程中早期被激活，在再生中后期進(jìn)行大量增殖,推測此神經(jīng)干細(xì)胞亞型是參與傷口愈合反應(yīng)的主要細(xì)胞群，并轉(zhuǎn)化為損傷缺失的神經(jīng)元；
2. 蝶的腦再生可能通過具有相似的機(jī)制分子調(diào)控干/?祖細(xì)胞的分化，部分再現(xiàn)腦發(fā)育過程中的神經(jīng)發(fā)生；
3. 蝶端腦空間轉(zhuǎn)錄組圖譜數(shù)據(jù)可從?https://db.cngb.org/stomics/artista?開放獲取。
【腫瘤研究】
案例三? Stereo-seq?揭示人類肝癌浸區(qū)促進(jìn)肝細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞串?dāng)_、局部免疫抑制和腫瘤進(jìn)展
文章題目：An?Invasive?Zone?in?Human?Liver?Cancer?Identified?by?Stereo-seq?Promotes?Hepatocyte–Tumor?Cell?Crosstalk,?Local?Immunosuppression?and?Tumor?Progression
發(fā)表期刊：Cell?Research
發(fā)表時(shí)間：2023年6月19?日
影響因子：44.100
DOl: 10.1038/s41422-023-00831-1
研究成果：
基于?Stereo-seq?和?SCRNA-seq，該研究揭示了人類肝癌腫瘤侵襲前沿特征,為開發(fā)肝癌和其他實(shí)體腫瘤的新治療策略鋪平了道路。
1. 定義了?500?μm?的侵襲前沿，為手術(shù)切除切緣提供理論依據(jù)；
2. 系統(tǒng)地揭示了肝癌侵襲前沿腫瘤細(xì)胞-干細(xì)胞-巨細(xì)胞三者相互作用構(gòu)建的免疫抑制微環(huán)境；
3. 前沿?fù)p傷肝細(xì)胞特征與原發(fā)及繼發(fā)肝癌臨床不良預(yù)后顯著相關(guān)，可作為潛在預(yù)后標(biāo)記物。
生信分析工具
Stereo-seq分析流程軟件包（Stereo-seq?Analysis?Workflow,?SAW）整合了時(shí)空組學(xué)技術(shù)?Stereo-seq?主要的基因表達(dá)分析和圖像數(shù)據(jù)處理工具，用于還原及可視化測序數(shù)據(jù)在芯片上的空間表達(dá)信息。Stereo-seq原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)?SAW流程處理后，得到可以用于下游生信分析的空間表達(dá)數(shù)據(jù)。
主要功能
- 還原?reads?空間位置:?利用空間特異性條形碼?CID?序列作為媒介，將測序 reads?映射回它們在組織中的原始空間位置；
- 獲取表達(dá)矩陣：還原回組織中空間位置的?reads 通過比對、注釋、過濾矯正和去重等一系列操作，得到每個(gè)基因在空間中的分布和表達(dá)，生成空間基因表達(dá)矩陣。在分析過程中，Stereo-seq?的亞細(xì)胞級高分辨率數(shù)據(jù)可以通過合并多個(gè)單元格形成不同大小的“箱(bin)”，來和其他模態(tài)的數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析；
- 圖像識別、分割和配準(zhǔn)：圖像分析模塊將顯微鏡拍照圖像和空間表達(dá)矩陣進(jìn)行對齊配準(zhǔn)，利用深度學(xué)習(xí)模型，從顯微鏡拍照影像圖中識別出組織和細(xì)胞，并進(jìn)行分割。圖像的識別和分割映射到空間表達(dá)矩陣后，便可以獲取組織區(qū)域內(nèi)或以細(xì)胞為單位的空間表達(dá)矩陣。
圖1 空間基因表達(dá)分布統(tǒng)計(jì)（bin200）
圖2 基因比對reads分布統(tǒng)計(jì)
圖3 組織覆蓋聚類統(tǒng)計(jì)（bin200）
樣品要求
1. OCT 包埋的新鮮組織；
2. 建議組織離體 30 分鐘內(nèi)包埋，或速凍 -80℃保存；
3. 1cm x 1cm標(biāo)準(zhǔn)芯片推薦包埋組織大?。航M織尺寸不應(yīng)超過 0.9 cm × 0.9 cm × 2 cm（長 × 寬 × 高），暨組織切片 / 芯片面積不應(yīng)超過時(shí)空芯片總面積的 80%；
4. 更詳細(xì)具體的內(nèi)容請參考時(shí)空組學(xué)送樣建議。
組織樣品處理原則
1. 盡量避免組織內(nèi)部 RNA 降解；
2. 樣本處理需保持組織原有結(jié)構(gòu)；
3. 樣本處理不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。
樣品運(yùn)輸要求
1. 包埋后的組織用錫箔紙包好,放入密封袋中密封并放入樣本盒中 -80C保存；
2. 寄送使用干冰運(yùn)輸，確保干冰充足，以運(yùn)輸 24h 計(jì)為 N，按消耗（N+0.5）X 5kg 計(jì)算送所需的干冰用量；
3. 寄送樣本前需填寫《時(shí)空組學(xué)樣本信息收集表》，將組織在包埋盒中的照片以及組織、切面等標(biāo)記的照片附在《時(shí)空組學(xué)樣本信息收集表》中。
