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時空轉(zhuǎn)錄組FFPE
時空轉(zhuǎn)錄組FFPE產(chǎn)品服務(wù)，是一項基于Sereo-seq技術(shù)的高精度空間定位轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)解決方案。該服務(wù)利用“隨機探針”對福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本中組織細(xì)胞內(nèi)的Total RNA分子進行原位捕獲，結(jié)合DNBSEQ?高通量測序平臺，通過帶有空間條形碼（Coordinate lD, CID）的cDNA進行測序和分析，精準(zhǔn)地將每個轉(zhuǎn)錄本映射回其在組織中的原始空間位置，實現(xiàn)全物種全轉(zhuǎn)錄組空間表達(dá)圖譜的構(gòu)建，助力臨床科研深入理解疾病的發(fā)生與發(fā)展機制。
此項技術(shù)的核心優(yōu)勢在于其納米級分辨率與厘米級全景視場的獨特結(jié)合，能夠在組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞及分子四個尺度上，同步進行空間轉(zhuǎn)錄組解析。不僅實現(xiàn)了對基因表達(dá)空間模式的高清描繪，更為深入探究細(xì)胞基因表達(dá)、形態(tài)特征與其所處局部微環(huán)境之間的復(fù)雜相互作用，奠定了強大而精確的研究基礎(chǔ)
產(chǎn)品優(yōu)勢
- 編碼及非編碼 RNA 共捕獲：基于隨機探針的技術(shù)原理, 可同時實現(xiàn) mRNA 和 non-coding RNA 的原位捕獲；
- 宿主和微生物共檢測：可同時捕獲微生物及其宿主的空間表達(dá)信息，進而探究宿主與微生物的互作關(guān)系；
- 超高分辨率空間單細(xì)胞分析：檢測分辨率達(dá)到500nm，可實現(xiàn)空間單細(xì)胞水平分析；
- 無物種限制：不僅可以應(yīng)用于人和小鼠，也可對其他物種樣本進行時空組學(xué)信息挖掘。
實驗流程
1. 樣品制備: 對FFPE石蠟包埋塊或蠟卷, 進行切片及 RNA 完整度評估后，再次進行FFPE石蠟塊切片，并將切片貼到時空芯片上；如果客戶提供FFPE蠟卷，進行RNA完整度評估和形態(tài)染色質(zhì)檢后，再將合格的樣品貼在時空芯片上；1.
2. 透化反轉(zhuǎn)錄組：將組織進行固定和滲透。時空芯片上布置有空間捕獲探針，能與組織細(xì)胞釋放的RNA 分子結(jié)合, 從而在芯片上抓取目標(biāo)樣本組織細(xì)胞的 RNA 分子，并合成cDNA；
3. 文庫制備及測序: cDNA合成后構(gòu)建測序文庫，用華大自主研發(fā)的國產(chǎn)化超高通量的測序儀完成測序；
4. 數(shù)據(jù)分析：針對下機數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，并完成全套分析，最終得到目標(biāo)樣本組織細(xì)胞在空間位置上表達(dá)的基因信息。
項目執(zhí)行周期
4個樣品標(biāo)準(zhǔn)流程（建庫，測序和SAW分析）的正常周期約為25個工作日；但由于前期樣品處理（切片、染色）步驟需反復(fù)溝通該周期不會記入項目執(zhí)行周期。
測序建議
- 測序平臺：DNBSEQ平臺
- 測序讀長：PE75
- 數(shù)據(jù)量推薦：正式實驗執(zhí)行樣品建議交付數(shù)據(jù)：2.5-3G clean reads （1cm x 1cm 時空轉(zhuǎn)錄組FFPE芯片）；測序數(shù)據(jù)質(zhì)量：Q30>80%。
文章題目：Molecular, metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses
發(fā)表時間：2024-02-20
發(fā)表期刊：Cancers
主要研究團隊：德克薩斯大學(xué)安德森癌癥中心等
影響因子：5.200
DOI：10.3390/cancers16050846
研究樣本
FFPE組織切片來源：高級別漿液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer，HGSOC）和非典型子宮內(nèi)膜增生（Atypical Endometrial Hyperplasia，AEH）；
分析數(shù)據(jù)來源：空間多組學(xué)平臺，包括Stereo-seq、MSI和seqIF。
腫瘤組織FFPE樣本的三維空間多組學(xué)圖譜
為生成一個全面的腫瘤組織三維空間多組學(xué)圖譜，研究人員把厚度85微米腫瘤組織分為3層（layers），在每一層中分別使用三種空間組學(xué)技術(shù)（MIS、seqIF和Stereo-seq）對組織切片進行檢測分析（圖7）。通過MIS技術(shù)，研究人員依次繪制了來自同一組織切片的代謝物、聚糖和胰蛋白酶肽的定位圖，檢測到了948種代謝物、164種聚糖和586種肽。通過seqIF分析，研究人員使用Keratin8/18和Col1A作為標(biāo)記，定義了HGSOC樣本的腫瘤、基質(zhì)和界面區(qū)域，并使用泛角蛋白和CD10作為組織分割標(biāo)記識別了AEH樣本的腺上皮、間質(zhì)和管腔區(qū)域。
實驗流程圖
研究人員使用Stereo-seq N 芯片（1 cm × 1 cm，F(xiàn)FPE）檢測了HGSOC和AEH組織樣本的3個FFPE切片的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到了該切片的全轉(zhuǎn)錄組空間表達(dá)圖譜（如上圖）。在HGSOC樣本的3個FFPE切片中，Stereo-seq捕獲的平均基因種類數(shù)范圍在每100 μm2（bin 20, 10 μm × 10 μm）59.44個到每100 μm2 （bin 20）97.85個；而在AEH樣本的3個FFPE切片中，Stereo-seq捕獲的平均基因種類數(shù)范圍在每100 μm2（bin 20）91.64至102個。
研究人員通過對Stereo-seq得到的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤樣本中存在較高的異質(zhì)性，且在同一個腫瘤組織樣本的三個layers間沒有明顯的批次效應(yīng)，聚類結(jié)果一致性高。此外，Stereo-seq還同時檢測到了同一組織切片中的微生物空間轉(zhuǎn)錄組。每張組織切片中總微生物組轉(zhuǎn)錄本數(shù)范圍在24,980至104,870，其中鑒定出了多種細(xì)菌、真菌和病毒，大部分屬于放線菌綱（Actinomycetia）和伽馬變形菌綱（Gammaproteobacteria）。
該研究通過整合FFPE樣本不同切面的空間多組學(xué)（包括Stereo-seq、MIS和seqIF）數(shù)據(jù)，生成了不同組織的三維多組學(xué)空間圖譜。這種利用不同的空間組學(xué)檢測技術(shù)構(gòu)建的TIME空間多組學(xué)圖譜，可以彌補單一檢測技術(shù)的局限性。利用該圖譜，研究人員探索了腫瘤組織的三維空間結(jié)構(gòu)并深入了解了其細(xì)胞鄰域的構(gòu)建方式，這些結(jié)果將有助于對TIME建立更全面的了解。該方法未來將在癌癥研究多個層面發(fā)揮作用，不僅有助于開發(fā)更好的生物學(xué)模型來檢測腫瘤治療方法，而且還可能為新的診療方案的開發(fā)提供線索。
空間表達(dá)熱圖
- 分析軟件版本：SAW 8.1，StereoMap 4.1
- Total reads：2,936,941,526
- Bin200(100 μm) MID中位數(shù)：36,892
- Bin200(100 μm) 基因中位數(shù)：5,299
- Bin20(10 μm) MID中位數(shù)：369
- Bin20(10 μm) 基因中位數(shù)：110
- 測序飽和度：75.10%
- 組織覆蓋率：68.58%
樣品信息
- 物種類型：小鼠（品系：C57BL/6；性別：雌；年齡：4-8周）
- 組織類型：肺
- 包埋方式：福爾馬林固定石蠟包埋
- DV200：>70%
- FFPE切片厚度：5 μm
適用樣本類型
適用于常見動物物種的 FFPE 蠟塊樣本、FFPE 蠟片樣本的時空轉(zhuǎn)錄組研究，主要適用于人類病理樣本，另外包括但不限于鼠、猴、豬等樣本。樣本需要使用10%福爾馬林或4%多聚甲醛（PFA）固定，其他固定條件可能與實驗不兼容需要先咨詢或自行承擔(dān)風(fēng)險。
1） FFPE蠟塊或者FFPE蠟卷皆可；
2） 每個蠟塊需用密封袋單獨包裝和清晰名稱標(biāo)注；
3） 蠟卷需盡量平展無破損，可用50mL離心管或者培養(yǎng)皿存放和運輸；
4） 更詳細(xì)具體的內(nèi)容請參考時空轉(zhuǎn)錄組FFPE送樣建議。
組織樣品處理原則：
盡量避免組織內(nèi)部 RNA 降解；
樣本處理需保持組織原有結(jié)構(gòu)；
樣本處理不影響后續(xù)實驗操作。
保存及運輸:
-蠟塊包埋后需4~8℃長期保存，常溫或更高溫度易導(dǎo)致核酸降解;
-蠟卷樣品需密封保存。在離心管外標(biāo)簽處寫上樣本名稱、日期及用途裝入自封袋并放入干燥劑密封保存。樣本制備完成后，可密封后暫放4℃冰箱，所有樣本準(zhǔn)備完成后需要盡快寄送；
-蠟塊或蠟卷樣品放入密封袋中密封，選擇大小合適的泡沫盒，且封口嚴(yán)實，保證泡沫盒密閉；
-寄送使用冰袋寄送，寄送時間 > 24 小時，應(yīng)不少于6塊冰袋（13 cm × 23 cm）；
-樣本做好防撞措施，建議使用泡沫、發(fā)泡紙等多層包裹以避免運送過程中碰撞影響樣本；
-寄送樣品前需填寫《時空組學(xué)樣品信息單》。填寫時請留意表格注意事項。
注：更多FFPE蠟塊和蠟卷樣品送樣建議細(xì)節(jié)請見《時空FFPE送樣建議》
