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宏基因組測序
產品介紹
微生物是地球上已知種類最多、數量最大、分布最廣的生物類群，僅原核微生物的總量大約就達4×1030-6×1030個。但是傳統的分離培養方法限制了認識微生物世界的視野。據估計，自然環境中超過99%的微生物不能用傳統的方法進行純培養，因而也不能對它們開展依賴于純培養的生物技術或基礎方面的研究。為了克服傳統純培養技術的不足，充分挖掘此類未培養微生物所蘊涵的巨大潛能，研究者們發展了宏基因組學的研究方法。利用分子生物學的研究方法繞過純培養技術來研究微生物的多樣性及功能，提供了一種探知微生物多樣性結構和功能基因組的免培養方法，是一條尋找新基因及其產物的新途徑。
研究內容
宏基因組研究以環境中所有微生物基因組為研究對象，通過對環境樣品中的全基因組DNA進行高通量測序，獲得單個樣品的飽和數據量，基于denovo組裝進行微生物群落結構多樣性，微生物群體基因組成及功能，特定環境相關的代謝通路等分析，從而進一步發掘和研究具有應用價值的基因及環境中微生物群落內部、微生物與環境間的相互關系。構建的環境微生物基因集，可為環境中微生物的研究、開發和利用提供基因資源庫。
產品優勢
性價比高：自主測序平臺，成本可控；
測序準確性高：DNBSEQ平臺滾環擴增構建DNB測序文庫，PCR擴增錯誤累積較少，高保真序列信息；
Duplication率低：DNBSEQ平臺Duplication率低，同樣的數據量有效數據多出3%-17%；
無index hopping擔憂：DNBSEQ平臺無index hopping擔憂，結果更可靠；
經驗豐富：有豐富的宏基因組項目經驗，特別是在人體微生物研究方面處于領先地位，已發表文章100+，其中CNS系列文章26篇。
樣本需求量低：常規宏基因組建庫建議樣本量在500ng以上；對于樣本獲取困難的樣本，也可以選擇微量建庫，樣本量可低至幾ng。
合作模式：有專門的meta大項目團隊，已發表多篇高水平文章。提供切實可行的項目方案，兼顧商業合作、科研合作優勢。
技術流程
質量合格的基因組 DNA 樣品通過超聲波高性能樣品處理系統（Covaris）隨機打斷，經過片段選擇后得到 300bp左右的片段。加上接頭，進行cluster制備，最后利用Paired-End的方法對插入片段進行測序，得到的原始數據經過質控和數據過濾，宏基因組組裝、基因預測、構建參考基因集，并進行后續的物種、基因、功能分析。
建庫流程
1) 將檢測合格的基因組DNA樣品用物理方法隨機打斷成300bp-400bp的片段；
2) 對打斷的DNA片段進行末端修復，在3’端連接A堿基；
3) DNA單鏈環化；
4) 去除未環化序列并進行純化；
5) 對構建的文庫進行質量檢測；
6) Make DNB；
7) 將質量檢測合格的文庫上機測序。
信息分析內容
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分析模塊 |
分析條款 |
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1.
項目概覽 |
項目信息 |
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2.
數據過濾 |
數據過濾統計 |
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3.
組裝 |
Denovo組裝 |
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4.
基因預測及基因集構建 |
基因預測及基因集構建 |
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5.
基因分析 |
1）
基因Venn圖(2-5個樣本或組別) |
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2）
基因差異分析（分組≥2，每組樣本數≥3） |
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6.
基因集功能注釋 |
Eggnog、KEGG、CARD、COG、CAZy、Swiss-prot，NR等 |
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7.
物種分析 |
1)
物種累積曲線圖分析 |
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2)
物種組成分析 |
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3)
物種差異分析（分組≥2，每組樣本數≥3） |
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4)
差異物種豐度熱圖（分組≥2，每組樣本數≥3） |
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8.
功能分析 |
1)
差異KO分析（分組≥2，每組樣本數≥3） |
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2)
差異KO豐度熱圖分析（分組≥2，每組樣本數≥3） |
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3)
差異pathway分析（分組≥2，每組樣本數≥8） |
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9.
多樣性分析 |
1）
物種水平Alpha多樣性分析 |
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2）
KO水平Alpha多樣性分析 |
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3）
物種水平Beta多樣性分析 |
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4）
KO水平Beta多樣性分析 |
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10. 網絡互作 |
1）
基于屬水平的network分析 |
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11. 相似性分析 |
1）
PCA分析 |
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2）
PCoA分析 |
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3）
NMDS分析 |
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4）
基于距離熱圖分析（物種、KO） |
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12. 關聯分析與模型預測 （個性化） |
1）
CCA分析（需提供環境因子數據） |
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2）
PERMANOVA/Adonis置換多元方差分析（默認分組因素對樣品差異的影響，如關注表型對樣品差異的影響需提供表型信息） |
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3）
物種與表型Spearman相關系數分析（需提供表型信息） |
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4）
MaAsLin分析（需提供表型信息） |
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5）
隨機森林--ROC曲線（分組=2，每組樣本數≥30） |
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13. 定制化分析 |
可結合客戶的需求，協商確定信息分析內容 |
腸道微生物代謝的長鏈飽和脂肪酸可增強大鼠的結腸運動
Zhao L, Huang Y, Lu L, et al. Saturated long-chain fatty acid-producing bacteria contribute to enhanced colonic motility in rats(Microbiome, 2018）.
胃腸功能紊亂是患有功能性胃腸病和其他腸道疾病的患者中常見的一種主要癥狀，慢性或反復發作??的胃腸運動障礙嚴重影響患者的生活質量。目前對胃腸功能紊亂的發病機制研究并不完整，這限制了胃腸功能紊亂的個體化和精準有效藥物的開發。前期研究表明腸道菌群在胃腸運動紊亂中起關鍵作用，但腸道菌群與宿主胃腸道運動相互作用及其作用機制尚不明確。
新生兒母親分離（NMS）的嚙齒動物模型是以一個成熟的長期結腸功能障礙模型，主要表現是結腸動力增強；有研究表明小鼠和大鼠在受NMS處理后會出現腸道微生物紊亂；而NMS模型中腸道菌群變化與胃腸動力增強的關系仍有待研究。本研究通過大鼠NMS模型和無菌模型，研究腸道菌群在胃腸功能紊亂中的作用，并深入挖掘其作用機制。
研究方案：
1.???? NMS模型大鼠腸道代謝水平的改變
分組：對照組VS NMS組
研究方法：代謝組學
通過代謝組學檢測NMS大鼠腸道代謝水平的變化，得到與NMS模型大鼠胃腸動力改變相關的代謝產物（SLCFA）。
2.???? 實驗驗證代謝水平的改變對大鼠胃腸的影響
體外實驗：通過器官浴系統研究不同劑量C17:0，C18:0以及游離LCFA受體拮抗劑對體外結腸環狀肌收縮的影響；
體內實驗：不同劑量C17:0和C18:0對正常大鼠（n=8/group）胃腸動力的影響
3.???? NMS模型大鼠腸道菌群及功能的改變
分組：對照組VS NMS組
研究方法：宏基因組學
通過宏基因組學檢測NMS大鼠腸道菌群及基因變化，得到與對應代謝產物（SLCFA）相關的菌群及基因
4.???? 驗證腸道菌群改變對胃腸運動及代謝產物的影響
偽無菌大鼠模型：將對照組和NMS組大鼠糞便分別移植到偽無菌大鼠體內，并檢測移植后大鼠的糞便菌群、基因及胃腸運動和對應代謝物水平的改變
抗生素治療：新霉素調節NMS大鼠腸道菌群，以及治療后胃腸動力、腸道菌群、代謝水平的變化
圖1. 實驗方案。a, 兩窩大鼠，對照組VS NMS組，胃腸動力檢測，腸道和糞便菌群檢測及糞便代謝物檢測；NMS 新霉素處理組和對照組；b, 無菌大鼠糞菌移植及腸道菌群檢測。
主要結果：
1.??? 代謝組分析發現結腸中過量的SLCFAs與NMS組腸動力增強有關。體內體外驗證結果表明SLCFAs刺激大鼠結腸收縮并增強排便頻率
圖2. 與對照組相比，NMS大鼠的腸道運動性增強，結腸內飽和長鏈脂肪酸（SLCFAs）含量增加。
2.??? 宏基因組分析發現NMS組中差異的糞便微生物與SLCFAs生成相關。糞便移植驗證結果表明NMS供體的糞便微生物使無菌小鼠排便頻率及結腸內SLCFAs含量增高。用新霉素改善NMS組腸道菌群失調可有效降低腸動力及SLCFAs產生。
圖3. 糞便微生物組的改變與NMS大鼠中的SLCFAs生成密切相關。
降糖藥療效和腸道菌群特征關系的研究
Analyses of gut microbiota and plasma bile acids enable stratification of patients for antidiabetic treatment（Nature communications, 2017）.
? ? ? ?眾所周知，小腸α葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖已在糖尿病患者，尤其是中國患者的治療中得到了廣泛應用。相比傳統的磺脲類藥物，阿卡波糖可以為糖尿病患者帶來更多代謝獲益，如體重下降、血脂譜改變等。除了降糖以外，是否還有其他機制可以解釋抗糖尿病藥物的代謝獲益？不同患者對于不同降糖藥的反應為何各不相同？腸道共生菌群是否在其中發揮作用？
? ? ? ?本研究通過多中心、隨機開放的臨床研究通結合腸道宏基因組及血漿、糞便代謝組學發現：常用降糖藥物阿卡波糖可顯著改善初發II型糖尿病患者腸道共生菌以及腸道共生菌膽汁酸代謝水平；并且腸道內富含擬桿菌的患者接受阿卡波糖治療后會表現出更多代謝獲益，如減重、降脂以及改善胰島素抵抗。本研究首次建立了降糖藥療效和腸道共生菌群特征關系的研究，這一發現不僅破解了阿卡波糖降糖外的代謝獲益的機制之謎，同時也為設計靶向腸道共生菌膽汁酸代謝的新型糖尿病藥物提供了新的研究思路。
樣本來源：
分組：阿卡波糖組（n=51），格列吡嗪組（n=43）；
樣本類型：糞便樣本（meta、代謝組）、血漿（代謝組）
研究方法：
宏基因組、代謝組學
主要結果：
1. 阿卡波糖和格列吡嗪兩種均有較好的糖尿病治療效果。在等效降糖情況下，阿卡波糖相較格列吡嗪具備更多改善患者體重、胰島素抵抗以及血脂的療效。
圖1 糖尿病患者阿卡波糖或格列吡嗪治療前后，相關臨床指標的變化
2. 阿卡波糖治療組膽汁酸代謝變化發生明顯的改變。這些代謝指標的變化與糖尿病臨床指標相關。
圖2 阿卡波糖治療前后膽汁酸代謝的變化
3. 與磺脲類藥物相比，阿卡波糖可以顯著調節患者的腸道菌群的結構與功能。阿卡波糖治療后，現場到菌群的基因和吳總數目均有減少。在物種層面，阿卡波糖治療可顯著提高多種益生菌（如雙歧桿菌和乳酸菌）豐度，并大幅降低梭菌和擬桿菌豐度。在功能層面，一方面，雙歧桿菌和乳酸菌替代擬桿菌成為膽鹽水解酶（BSH）基因的主要提供者；另一方面，合成疏水性次級膽汁酸的關鍵限速酶（7-α/β類固醇脫氫酶）的編碼基因豐度在治療后大幅度降低。這些腸道菌群的改變提示，由腸道微生物合成的肝毒性的疏水性次級膽汁酸（脫氧膽酸和石膽酸）生成減少；有益的親水性次級膽汁酸如熊脫氧膽汁酸生成得到促進。
圖3 阿卡波糖治療顯著影響腸道菌群的基因和物種結構。a-d，基因數目變化；e, 物種變化。
圖4 阿卡波糖治療影響次級膽汁酸代謝
a，阿卡波糖治療后，次級膽汁酸代謝酶發生顯著變化；b, 阿卡波糖治療前后提供bsh基因的菌群結構發生了變化；c, 阿卡波糖治療對膽汁酸代謝通路的影響。
DNA樣本要求
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Metagenomic Survey |
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樣本類型 |
總量 |
濃度 |
完整性（膠圖） |
純度 |
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Genomic DNA |
1μg |
12.5ng/μl |
主峰＞20Kb |
無蛋白，RNA/鹽離子等污染，樣本無色透明不粘稠 |
組織樣本要求
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組織類型? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? |
宏基因組測序 |
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Meta (糞便) |
≥200mg |
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Meta (土壤) |
≥1000mg |
對于Meta類樣品提取效果，取決于樣品中的微生物豐度，豐度低的樣品類型，極有可能無法提取到核酸。
常見樣本取樣方法
液氮速凍法
① 人和大型動物糞便樣品的采集
a)???? 準備好便盆和糞便容器，洗手，帶上手套收集新鮮的糞便樣本；
b)???? 在實驗室將裝好受試者糞便樣本，立即進行分裝并標記；
c)????? 用無菌牙簽或糞便取樣器截取樣品中段里部（糞便表層含有腸粘膜脫落細胞；
外部容易污染，且接觸空氣后，部分細菌 DNA 開始降解），取約50~100mg （約花生米大小，裝入2.0mL離心管不超過1/3體積）到無菌的2.0mL離心管中，每個樣本取3-5管備份；
d)???? 分裝好后，立即液氮速凍或直接放入-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。
??????? 注意：如糞便樣品量較多或不能馬上凍存，最遲要在2小時之內全部收集完。
② 小型動物（如鼠）顆粒糞便樣品采集
a) 動物顆粒糞便樣品，動物排便后立即裝入2.0mL離心管中（小鼠糞便3粒每管），放入-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。
③ 腸道內容物樣品采集
a)???? 用無菌解剖刀，在無菌狀態下取出整個腸道，切取所需腸段的內容物（條件允許的話，可在無菌操作臺進行）；
b)???? 用無菌手術刀挖取內容物，裝入無菌2.0mL離心管中，每管取約50~100mg （約花生米大小，裝入2.0mL離心管不超過1/3體積）到無菌的2.0mL離心管中，每個樣本取3-5管備份；
c)????? 分裝好后，立即放入 -80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。
④ 腸道組織樣本采集
a)???? 組織樣本用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕清洗，直到沒有內容物流出；
b)???? 用無菌的顯微鏡玻片刮取附著在表面的組織細菌，轉移到無菌的2.0離心管中；
c)????? 立即轉入-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。
⑤ 土壤meta樣品采集
a)???? 根據研究目的確定采樣范圍，取樣器具要事先消毒滅菌處理，開始采樣；
b)???? 去除表面浮土，使用乙醇火燒的鏟子挖取地下5~20cm的土層；
d)???? 去除可見雜質后，土壤過2mm篩網，建議每個樣品從3個及以上采樣點采集并混合而成，把土樣裝入無菌2.0mL離心管中，每管取約200mg （約花生米大小，裝入2.0mL離心管不超過1/3體積）到無菌的2.0mL離心管中，每個樣本取5管以上備份；
c)????? 分裝好后，立即轉入-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。
⑥ 水體樣本采集
a)???? 根據研究目的確定采樣深度和范圍；
b)???? 采集好的水樣需要通過濾膜進行過濾，可以根據水樣的渾濁程度選擇相應孔徑的濾膜；
c)????? 將濾膜轉移到2.0mL離心管中，立即轉移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。
??????????? 清亮水樣：可選擇小孔徑的濾膜，一般選0.22μm或0.45μm的濾膜，過濾水樣體積大于10L；
??????????? 渾濁水樣：過濾前靜置分離懸浮顆粒，也可以用大孔徑的濾膜預過濾一遍，再用小孔徑的濾膜進行過濾。
商業核酸保護液保存法
人糞便樣品可采用常溫采樣套裝，具體請按照說明書操作保存運輸樣品。
Q1. 如果存在較大的宿主的污染，且沒有宿主基因組的參考序列可以進行宏基因組測序嗎？
不可以，如果宿主的基因組序列在環境DNA中的量比較多，測序之后，我們沒有辦法通過已知的宿主基因組的序列來去污染，會對最后的分析結果造成很大影響，而且可用的數據量會很少；但是如果在提取的過程，宿主基因組的污染的量很少，后期的數據分析還是可用的，但是會存在一定的風險。
Q2. 進行多樣品比較分析的條件？
樣品數量超過2個，且有比較意義的，均可進行多樣品比較分析。但若要對明顯分組的樣品進行比較分析，建議至少2個組（每組至少10個樣品以平衡個體差異）。
Q3. 不同環境樣本數據量要求？
一般推薦簡單環境(如哺乳動物腸道)測序數據量為5G clean data；復雜環境（如土壤、海洋等）推薦數據量為10G clean data。
Q4. 宏基因組和16S研究主要有哪些區別，這兩種產品應該如何選擇
宏基因組和16S研究的差異：
1）研究內容：
宏基因組測序是對環境中所有微生物進行全基因組測序，可以研究群落的物種、基因、功能結構/差異等；
16S測序是對細菌的16S保守區域進行測序（真菌測18S或ITS信息），可以根據16S/18S/ITS序列的差異性進行物種分析，或者進行群落物種鑒定。也可以進行物種功能預測，該功能預測在功能差異分析中往往結果較差。
2）覆蓋范圍：
宏基因組研究理論上可以檢測環境中所有生物的基因組信息（包括原核、病毒、真核生物信息），環境中其他DNA污染會影響測序結果；
16S測序過程首先對目的區域進行擴增，只針對細菌（18S/ITS針對真菌）進行研究，測序過程受其他物種DNA影響較小。
3）樣本量需求
宏基因組研究對樣本量要求較高，一般要求500ng以上，低于500ng也可以進行微量建庫，不建議同一個項目同時選擇常規建庫和微量建庫。
16S測序只要能擴增出目的片段即可建庫測序。
4）測序策略
宏基因組建庫片段大小在300bp左右，不需要完全測通，目前多采用PE150；
16S測序策略依據目的片段大小而定，需要對目的片段完全測通，一般選擇PE250或PE300測序；目的片段更長的需要選擇長讀長測序。
如果客戶主要關注群落物種信息，或者是做菌種鑒定或希望發現新物種，推薦選擇16S測序；如果客戶希望挖掘群落相關基因或功能信息，則推薦選擇宏基因組測序。此外在大樣本研究中，為了節約成本，也可以先選擇16S進行初篩，然后選擇關鍵樣本或組別進行宏基因組測序，進行基因或功能挖掘。
Q5. 宏基因組研究推薦多少樣本量
宏基因組樣本量需求跟研究目的直接相關。如果側重于功能挖掘，一個或幾個樣本即可；如果側重于組間差異分析，如疾病相關的腸道菌群研究，一般需要較大的樣本量，一般每組樣本在50個左右，可參考對應的經典研究案例。
Q6. 對于有參考基因集的微生物群落研究（如人腸道微生物、小鼠腸道、豬腸道），是否可以直接比對已有的參考基因集進行物種、基因注釋，這種操作有什么優勢/劣勢？
可以。
優勢：已經公開發表的參考基因集一般是基于大樣本量數據構建而成，基因集覆蓋范圍廣，質量高；直接比對已有的數據庫不受單次測序數據質量的影響，結果準確，且信息分析周期較短。既適用于一般的商業項目，也適用于大型合作項目初篩。
劣勢：公開發表的參考基因集雖然覆蓋范圍較廣，來源特殊的樣本，可能和參考基因集差別較大；在大型研究中，可能也會忽略掉群落特異的（新的）基因或物種產生的影響；因此在大型項目中，可以先基于已發表的參考基因集進行初篩，同時基于新的項目數據進一步完善已發表的參考基因集。
