案例一：女性生殖道微環(huán)境及其與生殖健康的關(guān)聯(lián)

The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases (Nature communications, 2017).

       該項(xiàng)研究是目前最大規(guī)模的育齡女性生殖道微生態(tài)研究項(xiàng)目，采用16S檢測(cè)技術(shù)對(duì)女性盆腔與上下生殖道各部位菌群分布及與生殖系統(tǒng)疾病的關(guān)聯(lián)進(jìn)行研究。其研究成果打破了“盆腔和上生殖道為無菌環(huán)境”的傳統(tǒng)認(rèn)知，發(fā)現(xiàn)正常女性盆腔與上生殖道亦存在微生物，這首次揭示了生殖道從陰道到宮頸管、宮腔、輸卵管，直至盆腔的菌群結(jié)構(gòu)具有一定連續(xù)性，并提出盆腔與女性生殖道微生態(tài)環(huán)境和生殖系統(tǒng)健康及相關(guān)疾病具有重要的關(guān)聯(lián)性。

樣本來源：采集了110名因良性疾病接受手術(shù)治療的育齡女性生殖道不同部位的樣本，包括陰道下1/3（CL）、陰道后穹窿（CU）、宮頸管（CV）、子宮腔（ET）、輸卵管（FL）及盆腔液（PF）

主要方法：16S rRNA基因擴(kuò)增測(cè)序分析、實(shí)時(shí)定量PCR和微生物傳統(tǒng)培養(yǎng)法分析。

主要分析點(diǎn)：物種分析、樣本間多樣性分析、功能預(yù)測(cè)、表型關(guān)聯(lián)分析、評(píng)估模型構(gòu)建。

主要結(jié)果：

1. 上生殖道并非無菌環(huán)境，從陰道到輸卵管及盆腔，各部位微生物物種組成呈解剖結(jié)構(gòu)上的漸進(jìn)性變化
   

圖1. 生殖道不同部位微生物群落結(jié)構(gòu)。a, Weighted UniFrac PCoA圖；b, Unweighted UniFrac PCoA圖；c, 生殖道不同部位微生物豐度餅圖（屬水平）。

2. 同一個(gè)體不同部位的樣本間具有很高的相關(guān)性，不同個(gè)體間菌群組成變化明顯。此外，同一個(gè)體的宮頸管樣本與腹腔液樣本具有顯著的相關(guān)性，表明在普通人群中可以通過分析易取得的宮頸粘液樣本來評(píng)價(jià)宮腔和腹腔的菌群分布狀況。

圖2. 不同個(gè)體/同一個(gè)體不同部位微生物群落結(jié)構(gòu)一致性。a, 同一個(gè)體不同部位的微生物群落結(jié)構(gòu)與陰道下1/3（CL）的相似性；b, 同一個(gè)體不同部位的微生物群落結(jié)構(gòu)與盆腔液（PF）的相似性；c, 同一個(gè)體不同部位的微生物群落結(jié)構(gòu)Sorenson indices結(jié)果；d, 不同個(gè)體不同部位的微生物群落結(jié)構(gòu)Sorenson indices結(jié)果

3. 對(duì)表型信息進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)月經(jīng)周期、孕產(chǎn)次數(shù)以及子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥等多種疾病相關(guān)的不孕等都與生殖道菌群的變化有關(guān)。

圖3. 生殖道微生物功能（預(yù)測(cè)的）與女性生理周期的關(guān)聯(lián)分析

案例二：豬腸道菌群衍生物細(xì)菌素可增強(qiáng)早期斷奶仔豬腹瀉抵抗力

A Microbiota-Derived Bacteriocin Targets the Host to Confer Diarrhea Resistance in Early-Weaned Piglets (Cell host & microbe, 2018).

在豬養(yǎng)殖過程中，早期斷奶可以縮短豬的屠宰周期并改善母豬的繁殖性能。然而早期斷奶容易導(dǎo)致應(yīng)激性腹瀉，仔豬死亡率上升，生長(zhǎng)性能降低。使用抗生素可以預(yù)防仔豬斷奶腹瀉，降低飼養(yǎng)成本，但是由于病原菌抗生素抗性和抗生素殘留問題，歐盟已完全禁止在動(dòng)物飼養(yǎng)中使用抗生素。因此，尋找抗生素替代品以預(yù)防早期斷奶仔豬的腹瀉對(duì)于畜牧業(yè)和糧食安全至關(guān)重要。哺乳動(dòng)物腸道菌群與宿主健康密切相關(guān)，通過糞菌移植或益生菌/益生元調(diào)控腸道菌群已成為有前景的胃腸道疾病治療策略。

與商業(yè)雜交LY仔豬相比，CM仔豬（中國(guó)本土品種）對(duì)早期斷奶應(yīng)激誘導(dǎo)的腹瀉抵抗力更強(qiáng)。本研究在早期斷奶之前給LY仔豬口服CM仔豬糞便微生物群， LY仔豬的腹瀉抗性增強(qiáng)。通過比較糞菌移植組和對(duì)照組LY仔豬腸道微生物群的相對(duì)豐度，鑒定到兩個(gè)可能跟腹瀉抗性相關(guān)的菌種加氏乳桿菌LA39（Lactobacillus gasseri LA39 ）和乳酸桿菌（Lacto-bacillus frumenti），并通過qPCR進(jìn)行驗(yàn)證。腹瀉抵抗依賴于細(xì)菌素gassericin A，gassericin A與角蛋白19（KRT19）在腸上皮細(xì)胞質(zhì)膜上的結(jié)合對(duì)于增強(qiáng)液體吸收和減少分泌至關(guān)重要。本研究結(jié)果表明L. gasseri LA39和L. frumenti可能是預(yù)防哺乳動(dòng)物腹瀉的有效抗生素替代品。

方案設(shè)計(jì)：

對(duì)LY仔豬和CM仔豬按不同處理進(jìn)行分組如下：

①LY： LY仔豬，不經(jīng)任何處理，n=3；

②LY （saline）：LY仔豬，day10-day18隔日口服生理鹽水，n=3

③LY （high dose）：LY仔豬，day10-day18隔日口服高濃度CM仔豬糞菌懸液，n=3；

④LY （low dose）: LY仔豬，day10-day18隔日口服低濃度CM仔豬糞菌懸液，n=3；

⑤LY (oxytetracycline) ：LY仔豬，斷奶日（day21）肌肉注射長(zhǎng)效土霉素，n=3

⑥CM：CM仔豬，不經(jīng)任何處理，n=3

以上各組仔豬在斷奶后第3，5，6，8，11天收集糞便樣本，進(jìn)行16S V4和ITS2測(cè)序。

主要結(jié)果：

1.     糞菌移植仔豬腹瀉癥狀緩解，腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變

1）  接受CM糞菌移植的LY仔豬早期斷奶癥狀緩解

圖1. 各組仔豬腹瀉發(fā)病率（A）和腹瀉指數(shù)（B）

2）  LY (saline)組，LY (low dose)組和CM組糞便細(xì)菌有明顯差異；真菌無明顯分群。

圖2. 細(xì)菌和真菌群落PCoA 結(jié)果

3）  接受CM糞菌移植的LY仔豬細(xì)菌/真菌群落多樣性發(fā)生了改變

圖3. 細(xì)菌和真菌alpha diversity 結(jié)果

4）  LY (saline)組，LY (low dose)組和CM組糞便細(xì)菌功能結(jié)構(gòu)有明顯差異；

圖4. 仔豬腸道菌群功能pCoA圖（基于PICRUSt軟件 KEGG pathway分析）

2.     口服腹瀉抗性相關(guān)的腸道微生物可預(yù)防仔豬早期斷奶應(yīng)激引起的腹瀉。鑒定得到5個(gè)跟腹瀉抗性相關(guān)的菌種，其中加氏乳桿菌LA39（Lactobacillus gasseri LA39）和乳酸桿菌（Lactobacillus frumenti）單獨(dú)服用即可增強(qiáng)仔豬腹瀉抗性。

圖5. A-E, 三組仔豬腸道菌群物種注釋結(jié)果（門、綱、目、科、屬）；F，G，糞菌移植仔豬腸道菌群變化物種韋恩圖（F，細(xì)菌；G，真菌）；H，I，特定菌株對(duì)仔豬腹瀉發(fā)生率（H）和腹瀉抗性（I）的影響。

3.     腸道微生物介導(dǎo)的抗腹瀉功能依賴于分泌型Gassericin A。混合菌群移植和單獨(dú)服用LG/LF菌株的LY仔豬腸道菌群Gassericin A編碼基因GaaA豐度升高；口服GaaA缺陷LG菌株不能改善LY仔豬腹瀉癥狀。

4.     Gassericin A與腸上皮細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合，增強(qiáng)腸液吸收，減少腸液分泌。

5.     KRT19介導(dǎo)的Gassericin A與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合，對(duì)于Gassericin A介導(dǎo)的腸液吸收增強(qiáng)和液體分泌減少至關(guān)重要。

Gassericin A通過激活由雷帕霉素機(jī)制靶標(biāo)介導(dǎo)的磷酸二酯酶活性降低細(xì)胞周期核苷酸水平，增加腸液吸收并減少腸液分泌。

DNA樣本送樣建議

Meta rDNA Amplicon Sequencing包括Meta rDNA V3，V6，V4，V1-V3，V3-V4，V4-V5，V5-V6，ITS1，ITS2區(qū)域Amplicon建庫(kù)，這類文庫(kù)主要核心實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)是PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增成功率受模板DNA和體系純度（含有雜質(zhì)，鹽離子，色素，腐殖酸等）等因素影響，所以Meta rDNA Amplicon需要根據(jù)第一次建庫(kù)擴(kuò)增成功與否來判斷樣品是否合格。

組織樣本送樣建議

常見樣本采樣建議

（一）液氮速凍法

① 人和大型動(dòng)物糞便樣品的采集

a) 準(zhǔn)備好便盆和糞便容器，洗手，帶上手套收集新鮮的糞便樣本；

b) 在實(shí)驗(yàn)室將裝好受試者糞便樣本，立即進(jìn)行分裝并標(biāo)記；

c) 用無菌牙簽或糞便取樣器截取樣品中段里部（糞便表層含有腸粘膜脫落細(xì)胞；外部容易污染，且接觸空氣后，部分細(xì)菌DNA 開始降解），取約50~100mg （約花生米大小，裝入2.0mL離心管不超過1/3體積）到無菌的2.0mL離心管中，每個(gè)樣本取3-5管備份

d) 分裝好后，立即液氮速凍或直接放入-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。

如糞便樣品量較多或不能馬上凍存，最遲要在2小時(shí)之內(nèi)全部收集完。

② 小型動(dòng)物（如鼠）顆粒糞便樣品采集

動(dòng)物顆粒糞便樣品，動(dòng)物排便后立即裝入2.0mL離心管中（小鼠糞便3粒每管），放入-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。

③ 腸道內(nèi)容物樣品采集

a) 用無菌解剖刀，在無菌狀態(tài)下取出整個(gè)腸道，切取所需腸段的內(nèi)容物（條件允許的話，可在無菌操作臺(tái)進(jìn)行）；

b) 用無菌手術(shù)刀挖取內(nèi)容物，裝入無菌2.0mL離心管中，每管取約50~100mg （約花生米大小，裝入2.0mL離心管不超過1/3體積）到無菌的2.0mL離心管中，每個(gè)樣本取3-5管備份；

c) 分裝好后，立即放入-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。

④ 腸道組織樣本采集

a) 組織樣本用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕清洗，直到?jīng)]有內(nèi)容物流出；

b) 用無菌的顯微鏡玻片刮取附著在表面的組織細(xì)菌，轉(zhuǎn)移到無菌的2.0mL離心管中；

c) 立即轉(zhuǎn)入-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。

⑤ 土壤m(xù)eta樣品采集

a) 根據(jù)研究目的確定采樣范圍，取樣器具要事先消毒滅菌處理，開始采樣；

b) 去除表面浮土，使用乙醇火燒的鏟子挖取地下5~20cm的土層；

c) 去除可見雜質(zhì)后，土壤過2mm篩網(wǎng)，建議每個(gè)樣品從3個(gè)及以上采樣點(diǎn)采集并混合而成，把土樣裝入無菌2.0mL離心管中，每管取約50~100mg （約花生米大小，裝入2.0mL離心管不超過1/3體積）到無菌的2.0mL離心管中，每個(gè)樣本取3-5管備份；

d) 分裝好后，立即轉(zhuǎn)入-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。

⑥ 水體樣本采集

a) 根據(jù)研究目的確定采樣深度和范圍；

b) 采集好的水樣需要通過濾膜進(jìn)行過濾，可以根據(jù)水樣的渾濁程度選擇相應(yīng)孔徑的濾膜；

c) 將濾膜轉(zhuǎn)移到2.0mL離心管中，立即轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。

清亮水樣：可選擇小孔徑的濾膜，一般選0.22μm或0.45μm的濾膜，過濾水樣體積大于10L；

渾濁水樣：過濾前靜置分離懸浮顆粒，也可以用大孔徑的濾膜預(yù)過濾一遍，再用小孔徑的濾膜進(jìn)行過濾。

（二）商業(yè)核酸保護(hù)液保存法

人糞便樣品可采用常溫采樣套裝，具體請(qǐng)按照說明書操作保存運(yùn)輸樣品。

Q1. 16S產(chǎn)品有樣品數(shù)量的要求，需要所有樣品準(zhǔn)備好了才能進(jìn)行測(cè)序分析嗎？

A1：從分析角度，同一處理建議至少4個(gè)樣本進(jìn)行分析。從科學(xué)的角度來講，最好能夠整批樣品同時(shí)測(cè)序分析，既可以減少不同批次間的系統(tǒng)誤差，還能節(jié)省項(xiàng)目周期若樣品準(zhǔn)備有困難。也可以分批次啟動(dòng)，但可能帶來系統(tǒng)誤差問題。

Q2. 不同環(huán)境樣本數(shù)據(jù)量要求？

A2：一般推薦簡(jiǎn)單環(huán)境(如人腸道、發(fā)酵液等)測(cè)序數(shù)據(jù)量為50,000tags；復(fù)雜環(huán)境（如土壤、海水）等推薦數(shù)據(jù)量為100,000tags以上。

Q3. 16S測(cè)序能不能進(jìn)行功能分析？

A3：16S測(cè)序主要是基于16S rDNA 序列相似性進(jìn)行OTU聚類進(jìn)而進(jìn)行物種注釋及相關(guān)多樣性研究。因?yàn)?6S測(cè)序并沒有測(cè)到對(duì)應(yīng)的基因組信息，不能直接基于測(cè)序結(jié)果進(jìn)行功能注釋。

利用軟件PICRUSt可以進(jìn)行16S功能預(yù)測(cè)，該軟件的原理是：對(duì)由16S測(cè)序分析得到的OTU豐度進(jìn)行拷貝數(shù)均?化，得到樣品中可能出現(xiàn)的細(xì)菌及數(shù)目，從細(xì)菌的基因組信息得到對(duì)應(yīng)的基因信息及注釋信息，再結(jié)合均?化的OTU豐度來預(yù)測(cè)樣品中可能存在的各級(jí)KEGG通路及豐度值以及COG功能信息及豐度值。

基于16S的功能預(yù)測(cè)可以作為后續(xù)功能研究提供參考，但由于該分析不能反映群落中因基因表達(dá)差異導(dǎo)致的功能差異。如果主要關(guān)注功能差異，最好選擇宏基因組測(cè)序來進(jìn)行功能研究。

Q4. 16S相關(guān)文章中選擇的測(cè)序區(qū)域各不相同（如V4，V3-V4，V1-V3，V3等），選擇的依據(jù)是什么，選擇哪個(gè)區(qū)域比較好？

A4：不同物種不同區(qū)域多樣性不同，選擇不同區(qū)域測(cè)序結(jié)果會(huì)有不同，可能會(huì)造成物種多樣性的低估或高估。在非全長(zhǎng)16S測(cè)序的情況下，測(cè)序區(qū)域也并非越長(zhǎng)越好，跟全長(zhǎng)16S結(jié)果最相近的測(cè)序區(qū)域即是最優(yōu)選擇。

如無特殊要求，我們一般推薦V4區(qū)測(cè)序，有文獻(xiàn)表明V4區(qū)測(cè)序結(jié)果和全長(zhǎng)的結(jié)果一致性較好。

根據(jù)我們大量的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，目前測(cè)序項(xiàng)目較多的區(qū)域?yàn)閂4, V1-V3, V3-V4, V4-V5, V5-V6，具體項(xiàng)目測(cè)序區(qū)域也可參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行選擇。

圖1. 不同物種16S各可變區(qū)變異程度不同

Q5. 16S樣本要求有哪些，樣本準(zhǔn)備有哪些注意事項(xiàng)？

A5：對(duì)16S樣本要求如下：

一般16S建庫(kù)選擇基因組樣本，推薦樣本量在50ng以上，如果樣本準(zhǔn)備困難，大于0ng也可以嘗試建庫(kù)。

16S產(chǎn)品建庫(kù)受模板DNA和體系純度（含有雜質(zhì)，鹽離子，色素，腐殖酸等）等因素影響，在取樣過程中，盡量減少宿主細(xì)胞含量及其他雜質(zhì)的影響。

樣本采集后盡快放入-80℃凍存，干冰運(yùn)輸，減少樣本降解導(dǎo)致的微生物群落結(jié)構(gòu)變化。

Q6. 我的樣本檢測(cè)合格了，樣本量也達(dá)到了推薦樣本量要求，卻建庫(kù)失敗了，可能是什么原因造成的，有沒有什么解決方案？

A6：這種情況常見于宿主微生物樣本，該類樣本通常還有大量的宿主DNA，由于樣本檢測(cè)中不能區(qū)分宿主和微生物DNA，實(shí)際檢測(cè)到的DNA其實(shí)絕大多數(shù)都是宿主DNA，導(dǎo)致檢測(cè)到的樣本量很高，卻建庫(kù)失敗的情況。

對(duì)于這類樣本，推薦在樣本制備過程中進(jìn)行特殊處理，盡量減少宿主DNA含量。目前市面上有可以去宿主DNA的試劑盒（如QIAamp DNA Microbiome Kit），對(duì)于宿主含量較高的樣本如唾液、粘膜樣本等，可以選擇對(duì)應(yīng)的試劑盒處理。

Q7. 16S測(cè)序一般推薦多少樣本量？

A7：16S樣本多樣性及組間差異分析是基于統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行的分析，一般樣本數(shù)越多，統(tǒng)計(jì)結(jié)果越準(zhǔn)確。最低樣本數(shù)要求如下：

樣本間多樣性分析（n≥4），組間多樣性分析樣本（組別≥2，每組樣本數(shù)n≥3）。

Q8. 16S測(cè)序如果樣本含有較多宿主DNA，是否需要增加測(cè)序數(shù)據(jù)量？

A8：16S擴(kuò)增子測(cè)序是對(duì)微生物16S rDNA 特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序分析的產(chǎn)品，擴(kuò)增產(chǎn)物不包含宿主的信息。所以樣本中宿主DNA并不會(huì)對(duì)測(cè)序結(jié)果造成影響（宿主DNA含量過高可能會(huì)導(dǎo)致建庫(kù)失敗），測(cè)序過程中也無需增加數(shù)據(jù)量。

宏基因組測(cè)序是對(duì)環(huán)境中所有物種進(jìn)行全基因組測(cè)序的產(chǎn)品，樣本中宿主DNA含量較高會(huì)導(dǎo)致宏基因組測(cè)序宿主比例偏高，微生物有效數(shù)據(jù)量相對(duì)較少，這種情況下可以通過增加測(cè)序數(shù)據(jù)量來增加有效數(shù)據(jù)。