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細菌de novo測序
產品介紹
細菌基因組de novo是對細菌基因組測序后從頭組裝。步驟為先將細菌的染色DNA機械地隨機切割成一定相對分子質量范圍的片段，根據不同的測序策略，構建對應大小文庫，然后進行大規模測序。最終的組裝水平根據研究的需要和細菌本身的特點而定，其中最高的指標是一條contig，即基因組的完整序列。
在組裝的基礎上，進行基因組組分分析，功能注釋等分析，推測ORF是否為真實蛋白編碼序列，檢查功能位點，分析共有序列或特征序列、單個基因或基因間相互作用、表達調控等功能，細菌de novo測序已取代傳統方法成為研究細菌進化遺傳機制，關鍵功能基因的重要工具。可以預測重要基因和蛋白以了解其功能和可能機制；在研究病原菌的致病性與疾病的預防和治療方面，可以鑒定致病相關基因、開發和研究疫苗、開發新型抗生素等；在研究細菌進化方面，可以研究種內進化關系。
產品優勢
平臺多樣：多平臺聯合應用打造“極致完成圖”
交付快速：有完善的分析流程，一鍵式交付，周期短
附加值高：結題報告文章化，深入挖掘基因組信息
經驗豐富：已完成上萬個細菌de novo項目，發表細菌基因組文章170多篇。
個性化分析：依據客戶需求制定個性化信息分析方案
技術流程
測序策略
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小片段文庫 |
PacBio
/ Nanopore文庫 |
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細菌de novo |
初級組裝 |
1
Gb |
- |
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完成圖 |
1
Gb |
1
Gb |
信息分析內容
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信息分析條款 |
信息分析內容 |
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基因組組分分析 |
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基因功能分析 |
2. 綜合性抗生素耐藥性（CARD）數據庫
2. 碳水化合物相關酶（CAZy）數據庫注釋 |
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比較基因組分析（需要參考序列） |
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定制化分析 |
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案例一：鼠疫桿菌遺傳多樣性研究
Historical variations in mutation rate in an epidemic pathogen, Yersinia pestis
期刊：PNAS 發表時間：2013
案例描述：
鼠疫（plague）是鼠疫桿菌（Yersinia pestis, Y pestis）借鼠蚤傳播為主的烈性傳染病，是廣泛流行于野生嚙齒動物間的一種自然疫源性疾病，也叫做黑死病。臨床上表現為發熱、嚴重毒血癥癥狀、淋巴結腫大、肺炎、出血傾向等。鼠疫在世界歷史上曾有多次大流行，在3個有記載的大流行期間導致了大約2億人死亡，因此被冠上"最具毀滅性傳染病"的名頭。三次大流行第一次發生在公元6世紀，從地中海地區傳入歐洲，死亡近1億人；第二次發生在14世紀，波及歐洲、亞洲和非洲；第三次是18世紀，傳播32個國家。14世紀大流行時波及中國。鼠疫桿菌是鼠疫的病原體，過去的研究表明其由于起源較近，遺傳多樣性非常有限。
研究結果：
- SNP突變率分析
鑒定出的2,326個單核苷酸多態性（SNPs）中有2,298個SNPs，在進化譜系中僅出現過一次，并根據此構建了MSTree。
- 鼠疫傳播路徑分析
系統進化樹分析結果表明鼠疫起源于中國的青藏高原，其傳播途徑類似于古代絲綢之路及茶馬古道的線路，表明鼠疫的傳播與人類活動密切相關。
案例二：結核分枝桿菌群體進化和耐藥分析
Genome sequencing of 161 Mycobacterium tuberculosis isolates from China identifies genes and intergenic regions associated with drug resistance
期刊：Nature Genetics 發表時間：2013
材料與背景：
中國12個省份的161株結核分枝桿菌（其中44株敏感菌，94株多耐藥菌，23株泛耐藥菌）
結果分析：
1. 通過本項研究，獲得了我國臨床耐藥結核分枝桿菌中已知耐藥相關基因的突變情況，新發現了與結核分枝桿菌耐藥性相關的72個編碼基因和28個基因間隔區的突變。
2. 中國地區的結核病人主要受到lineage 2和lineage 4兩系結核分枝桿菌的侵染，而且，其中95%的lineage 2結核分枝桿菌屬于國際上比較關注的北京家族。北京家族的結核分枝桿菌一直被認為有更強的毒性和更容易產生耐藥性。
DNA樣本要求
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短讀長測序 |
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樣本類型 |
總量 |
濃度 |
完整性（膠圖） |
純度 |
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基因組DNA |
1 μg |
12.5 ng/μl |
主峰＞20Kb |
無蛋白，RNA/鹽離子等污染，樣本無色透明不粘稠 |
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長讀長測序 |
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樣本類型 |
總量 |
濃度 |
OD |
完整性（膠圖） |
純度 |
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基因組DNA-Pacbio平臺 |
3.5 μg |
80 ng/μl |
OD260/280: 1.6-2.2 OD260/230: 1.6-2.5 |
無降解或輕微降解（主峰在40K附近且彌散不低于20Kb） |
無蛋白，RNA/鹽離子等污染，樣本無色透明、不粘稠 |
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基因組DNA-Nanopore平臺 |
1 μg |
45 ng/μl |
OD260/280: 1.8-2.2 OD260/230: 1.8-2.2 |
無降解或輕微降解，基因組主峰在30K附近或以上，且彌散不低于20K |
無蛋白，RNA/鹽離子等污染，樣本無色透明、不黏稠 |
Q1. 現在細菌完成圖是否會限制基因組大小、GC含量、質粒情況，是否交付質粒信息？
A1：目前細菌完成圖不再限制基因組大小、GC含量、染色體數目及質粒情況；無需提前評估，都可以按照完成圖的策略進行操作（基因組遠大于10M的細菌仍需慎重對待）；除了交付基因組組裝結果以外還可以從組裝結果中識別出質粒序列，并判斷是否成環，挖掘質粒相關信息。
基因組大小在10M以內（包括10M或略高于10M）的細菌都可以選擇以下策略：
PacBio：10-15Kb文庫，1cell；DNBSEQ：200-300bp文庫，1G測序數據。
Q2. 華大細菌完成圖產品有哪些優勢？
A2：華大細菌完成圖目前是用PacBio Sequel II平臺進行測序，測序產量高，讀長長，無樣本間交叉污染。除了一般承諾的“1 contig, 0gap”，還可以進行以下分析：
成環判定：明確判定細菌基因組序列數目及是否成環
零點確定：確定環狀細菌基因組序列起始位點，便于序列比對分析
質粒識別：組裝結果中識別出質粒序列，并判斷是否成環，挖掘質粒相關信息
甲基化分析：基于三代測序進行甲基化位點分析及對應的motif序列分析
表1. 組裝結果示例
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樣本名 |
染色體數目 |
Total length (bp) |
GC含量（%） |
ID: circular/linear: length |
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Ⅰ |
2 |
5,706,418 |
45.68 |
Chromosome_1:
circular:3383737 Chromosome_2: circular:2322681 |
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Ⅱ |
2 |
7,699,152 |
70.36 |
Chromosome_1:
linear:7685618 Plasmid_1: circular:
13534 |
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Ⅲ |
1 |
10,397,305 |
70.82 |
Chromosome_1: linear:10397305 |
