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全基因組Bisulfite甲基化測(cè)序
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
全基因組甲基化Bisulfite測(cè)序是DNA甲基化研究的黃金標(biāo)準(zhǔn)，它通過Bisulfite處理和全基因組DNA測(cè)序結(jié)合的方式，對(duì)整個(gè)基因組上的甲基化情況進(jìn)行分析，具有單堿基的分辨率，可精確評(píng)估單個(gè)C堿基的甲基化水平，覆蓋范圍廣。它可以構(gòu)建精細(xì)甲基化圖譜，建立表觀遺傳學(xué)研究數(shù)據(jù)庫(kù)，為后續(xù)大規(guī)模開展不同樣品間的甲基化差異分析提供參考圖譜。
技術(shù)流程
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
技術(shù)穩(wěn)定性、重復(fù)性好：從樣本檢測(cè)到文庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序，每一步均有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)操作SOP和對(duì)應(yīng)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，保證每一個(gè)樣本都得到真實(shí)的測(cè)序結(jié)果。
Bisulfite轉(zhuǎn)化率高：經(jīng)過不斷優(yōu)化建庫(kù)方案，華大的甲基化建庫(kù)BS平均轉(zhuǎn)化率高達(dá)99%以上，作為文庫(kù)構(gòu)建的質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行嚴(yán)格控制。
單堿基分辨率：精確分析每一個(gè)C堿基的甲基化狀態(tài)。
準(zhǔn)確性和可靠性高：準(zhǔn)確區(qū)分甲基化的C和未甲基化的C。
檢測(cè)范圍廣：覆蓋全基因組范圍內(nèi)的所有位點(diǎn)。
無(wú)偏向性：反映真實(shí)的甲基化狀態(tài)。
經(jīng)驗(yàn)豐富：執(zhí)行了上千個(gè)項(xiàng)目，數(shù)萬(wàn)個(gè)樣本，合作發(fā)表文章一百多篇。
信息分析
表1 標(biāo)準(zhǔn)信息分析內(nèi)容
信息分析條款 | 信息分析內(nèi)容 |
標(biāo)準(zhǔn)信息分析 | 1. 數(shù)據(jù)基本處理與質(zhì)控； 2. 比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)； 3. 甲基位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)與分析： 3.1. 甲基化位點(diǎn)鑒定； 3.2. 甲基化位點(diǎn)類型統(tǒng)計(jì)； 3.3. C位點(diǎn)甲基化水平分析（全基因組，染色體，功能元件）； 3.4. 甲基化位點(diǎn)序列特征Motif圖； 3.5. 甲基化水平IGV可視化文件（.bw）； 3.6. 全基因組甲基化水平分布（樣本/分組）； 3.7. 基因基因上下游甲基化水平分布（樣本/分組）； 3.8. 樣本相關(guān)性和PCA分析； 4. 差異甲基化分析： 4.1. 差異甲基化位點(diǎn)（DMC）鑒定； 4.2. DMC相關(guān)基因GO和 KEGG富集分析； 4.3. DMC錨定Promoter區(qū)域相關(guān)基因GO和KEGG富集分析； 4.4. 差異甲基化區(qū)域（DMR）鑒定； 4.5. DMR相關(guān)基因GO和KEGG富集分析； 4.6. DMR錨定Promoter區(qū)域相關(guān)基因GO和 KEGG富集分析。 |
Dr. Tom標(biāo)準(zhǔn)分析 | 1．數(shù)據(jù)基本處理與質(zhì)控; 2．全基因組甲基化水平分析; 3．基因附近的甲基化水平分布; 4． TE附近的甲基化水平分布; 5．各染色體的平均甲基化水平; 6．基因組不同轉(zhuǎn)錄元件中的DNA平均甲基化水平; 7． mCG、mCHG和mCHH的甲基化胞嘧啶統(tǒng)計(jì); 8．差異甲基化DMR的檢測(cè); 9．DMR相關(guān)基因的GO和Pathway分析; |
定制化信息分析 | 可結(jié)合客戶的需求，協(xié)商確定定制化信息分析內(nèi)容 |
文章題目：DNA damage triggers heritable alterations in DNA methylation patterns in Arabidopsis.
發(fā)表期刊：Molecular Plant（IF=24.1）
發(fā)表時(shí)間：2025年1月
研究技術(shù)：WGBS、RNA-Seq
研究結(jié)果：
DNA甲基化在維持基因組穩(wěn)定性與調(diào)控基因表達(dá)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是動(dòng)植物中動(dòng)植物中高度保守的表觀遺傳機(jī)制。目前尚無(wú)足夠的證據(jù)支持DNA損傷會(huì)導(dǎo)致全基因組范圍內(nèi)的DNA超甲基化。
本研究以積累單鏈 DNA 損傷的植物模型為研究對(duì)象，揭示 DNA 損傷顯著提升基因組 DNA 甲基化水平，其影響與損傷強(qiáng)度及 DDR 通路密切相關(guān)。機(jī)制上，DNA損傷通過調(diào)控 DREAM 復(fù)合體增加對(duì)稱性甲基化，通過 RdDM 途徑增加非對(duì)稱性甲基化。移除損傷或抑制 DDR 可逆轉(zhuǎn)非對(duì)稱性甲基化，但對(duì)稱性 CG 甲基化穩(wěn)定，具遺傳記憶特性。研究表明 DNA 損傷是驅(qū)動(dòng)植物基因組 DNA 甲基化水平及模式形成與演變的重要因素。
圖1.DNA損傷驅(qū)動(dòng)DNA甲基化的產(chǎn)生與演變的機(jī)制
案例二 DNA 甲基化應(yīng)用于異染色質(zhì)與維持基因組穩(wěn)定性[2]
文章題目：H3T11 phosphorylation by CKII is required for heterochromatin formation in Neurospora.
發(fā)表期刊：Nucleic Acids Research（IF=13.1）
發(fā)表時(shí)間：2024年9月
研究技術(shù)：WGBS 、ChIP-Seq
研究結(jié)果：
異染色質(zhì)是真核生物基因組的一個(gè)關(guān)鍵特征，對(duì)于維持基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要。然而，在絲狀真菌粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）中，導(dǎo)致重復(fù)誘導(dǎo)點(diǎn)突變遺跡處異染色質(zhì)起始的機(jī)制尚不清楚，且獨(dú)立于經(jīng)典的RNAi途徑。
本研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白激酶II (CKII)及其激酶活性是在5H-cat-3區(qū)域明確的5kb異染色質(zhì)上形成異染色質(zhì)和其鄰近的cat-3基因的轉(zhuǎn)錄抑制所必需的。催化亞基CKA與5H-cat-3區(qū)域內(nèi)的H3T11磷酸化（H3pT11）共定位，CKA基因的缺失會(huì)導(dǎo)致H3T11磷酸化顯著減少。此外，CKII激酶活性的喪失會(huì)導(dǎo)致H3pT11、H3K9me3和DNA甲基化水平顯著降低，這表明CKII通過促進(jìn)H3T11磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)異染色質(zhì)的形成。
圖 2 CKII在異染色質(zhì)形成和DNA甲基化中的重要作用
案例三 TET1 雙加氧酶為胰腺 β 細(xì)胞分化過程中 FOXA2 相關(guān)染色質(zhì)重塑所必需（DNBSEQ WGBS） [3]
文章題目：TET1 dioxygenase is required for FOXA2-associated chromatin remodeling in pancreatic beta-cell differentiation.
發(fā)表期刊：Nature Communications（IF=15.7）
發(fā)表時(shí)間：2022年7月
研究技術(shù)：ATAC-seq、CMS-IP、WGBS、ChIP-Seq
研究結(jié)果:
本研究綜合利用全基因組分析鑒定獨(dú)特的細(xì)胞類型特異性高甲基化區(qū)域（hyper-DMRS）顯示出染色質(zhì)活性降低并顯著與FOXA2結(jié)合，而FOXA2是一個(gè)對(duì)胰腺分化很重要的先鋒轉(zhuǎn)錄因子。
全基因組定位 TET1 顯示 TET1 共定位于 FOXA2 靶點(diǎn)的一個(gè)子集，它在胰腺祖細(xì)胞中具有高水平的活性染色質(zhì)修飾。結(jié)合這些發(fā)現(xiàn)和 TET1 失活后功能性 β 細(xì)胞的缺陷生成，該研究不僅揭示了 TET1 依賴的表觀遺傳調(diào)控在確定 β 細(xì)胞身份中的重要作用，而且為 TET 雙加氧酶與先鋒轉(zhuǎn)錄兩者在譜系規(guī)范中的復(fù)雜互作關(guān)系提供了一個(gè)新的機(jī)制線索。
參考文獻(xiàn)：
[1] Li J, Liang W, He XQ, Qian W. DNA damage triggers heritable alterations in DNA methylation patterns in Arabidopsis. Mol Plant. 2025 Mar 3;18(3):501-512.
[2] Tian Y, Zhang C, Tian X, et al. H3T11 phosphorylation by CKII is required for heterochromatin formation in Neurospora. Nucleic Acids Res. 2024 Sep 9;52(16):9536-9550.
Li J, Wu X, Ke J, et al. TET1 dioxygenase is required for FOXA2-associated chromatin remodeling in pancreatic beta-cell differentiation. Nat Commun. 2022 Jul 7;13(1):3907.
1. 甲基化位點(diǎn)水平分布
對(duì)于鑒定出的甲基化位點(diǎn)，計(jì)算其甲基化水平，公式為：ML=mC/(mC+umC)。其中ML為甲基化水平，并統(tǒng)計(jì) 不同類型的C堿基（mCG、mCHG和mCHH )的甲基化水平分布。
圖1.樣本甲基化位點(diǎn)水平分布圖
2. 甲基化位點(diǎn)上下游特征序列 Motif 分析
Motif預(yù)測(cè)分析主要用于識(shí)別DNA、RNA或蛋白質(zhì)序列中具有生物學(xué)功能的短保守序列模式，可以表征序列保守性以及可能在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮的作用。
本分析將在全基因組各位點(diǎn)類型（ CG，CHG，CHH ）中鑒定為甲基化的C位點(diǎn)及其上下游 9bp 的堿基序列作Logo Plots，研究不同序列環(huán)境中發(fā)生甲基化修飾的胞嘧啶上下游的序列特征。
圖2.甲基化C位點(diǎn)相鄰堿基 Motif 圖
3. 樣本相關(guān)性與PCA分析
進(jìn)行樣本相關(guān)性與PCA分析。樣品間甲基化水平的相關(guān)性是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標(biāo)。相關(guān)系數(shù)越接近1，表明樣品之間甲基化模式的相似度越高。
圖3.樣本相關(guān)性熱圖與PCA分析圖
4. 差異性甲基化區(qū)域（DMR）相關(guān)基因GO分析
基因本體論（Gene ontology，GO）是所有物種中最主要的了解基因和基因產(chǎn)物屬性的生物信息學(xué)分析手段，GO分析能夠用于鑒定基因產(chǎn)物的性能，它包含了三類基因功能信息：細(xì)胞組分（Cellular Component），分子功能（Molecular Function）和生物學(xué)過程（Biological Process）。為了探討表觀遺傳變異在通路和生物學(xué)過程中起到的作用，我們對(duì)DMR相關(guān)的基因進(jìn)行了GO分析。
圖4.DMR相關(guān)基因 GO 富集柱狀圖
5. 差異性甲基化區(qū)域（DMR）相關(guān)基因Pathway分析
KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)整合了基因組、化學(xué)以及系統(tǒng)功能信息，特別是測(cè)序得到的基因集與細(xì)胞、生物體以及生態(tài)環(huán)境的系統(tǒng)性功能相關(guān)聯(lián)。所有樣品中的DMR相關(guān)基因均用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。
圖5.DMR相關(guān)基因的Pathway功能顯著性富集分析圖
1、核酸樣本
表1 DNA送樣建議
樣本類型 | 總量 | 濃度 | 完整性（膠圖） | 純度 |
Genomic DNA | ≥0.5μg | ≥12.5ng/μL | 主峰＞20Kb | 無(wú)蛋白，RNA/鹽離子等污染， 樣本無(wú)色透明不粘稠 |
2、組織樣本
表2 組織送樣建議
組織類型 | 具體要求 |
新鮮培養(yǎng)細(xì)胞 (細(xì)胞數(shù)) | ≥1×106 cells |
新鮮動(dòng)物組織干重 | ≥50 mg |
新鮮植物組織干重 | ≥200 mg |
全血（哺乳動(dòng)物） | ≥0.6 mL |
全血（非哺乳動(dòng)物） | ≥0.1 mL |
Q1: Bisulfite-Seq在項(xiàng)目開始之前需要考慮哪些因素？
A1：Bisulfite-Seq在項(xiàng)目開始之前需要考慮以下因素：是否為低甲基化率的物種；該物種的基因組完成情況如何（影響B(tài)S-SEQ的比對(duì)）；基因組是否存在復(fù)雜因素：GC含量偏高、雜合度偏高、轉(zhuǎn)座子、重復(fù)區(qū)域等。
Q2：可以對(duì)無(wú)參考基因組的物種進(jìn)行Bisulfite研究嗎？
A2：Bisulfite-Seq強(qiáng)烈依賴基因組的完成程度，基因質(zhì)量的好壞直接影響后續(xù)的分析結(jié)果，因此更適合有完整基因組信息的物種。
Q3：如果合作伙伴自己建庫(kù)，能否提供上機(jī)測(cè)序？如何進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)并保證測(cè)序質(zhì)量？
A3：合作伙伴自己建的文庫(kù)，可以上機(jī)測(cè)序。如果用標(biāo)準(zhǔn)的Illumina kit，要注明kit的類型及貨號(hào)。如果不是使用Illumina kit建庫(kù)，那么合作伙伴提供信息單的同時(shí)必須說(shuō)明建庫(kù)方法、使用的試劑盒及品牌，以及提供建庫(kù)所用的接頭引物序列和預(yù)期文庫(kù)片段大小。如果是index文庫(kù)，要注明index的位置以及index的序列。若只完成部分建庫(kù)過程請(qǐng)務(wù)必注明清楚；如果文庫(kù)是PCR產(chǎn)物建庫(kù)或者插入片段中有特定序列，請(qǐng)?jiān)谔峁┑臉悠沸畔沃姓f(shuō)明，否則會(huì)極大地影響數(shù)據(jù)質(zhì)量。對(duì)合作伙伴文庫(kù)的檢測(cè)，首先用 Agilent 片段分析儀確定片段大小是否符合；然后通過Q-PCR精確定量確定上機(jī)體積。
Q4：Bisulfite的轉(zhuǎn)化率是多少？
A4：Bisulfite轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%以上；如果樣品的DNA不存在不發(fā)生甲基化的DNA作為對(duì)照，都會(huì)在樣品中混入control DNA來(lái)驗(yàn)證Bisulfite的轉(zhuǎn)化率。
