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ChIP-Seq
染色質免疫共沉淀（ChIP）是在體內環境中研究蛋白質與DNA相互作用的經典實驗方法，廣泛應用于組蛋白修飾、特定轉錄因子的基因調控作用等相關領域。隨著新一代測序技術的發展和成熟，染色質免疫沉淀實驗與高通量測序的整合——Chromatin Immunoprecipitation Sequencing （ChIP Sequencing ），可在全基因組范圍對蛋白結合位點進行高效而準確的篩選與鑒定，同時也為研究的深入開展打下基礎。
采用特異性抗體對目的蛋白進行免疫沉淀后，分離與其結合的基因組DNA片段，再通過高通量測序與數據分析，在全基因組范圍內尋找目的蛋白的DNA結合位點，并且可以基于多個樣品進行差異比較。
技術流程
技術優勢
數據利用率高：SE50 最優讀長，無數據浪費
低起始量：DNBSEQ 平臺最低起始量僅需 5 ng，5 ng 以下亦可做定制化
交付周期短：30 個工作日交付結果（不包括 ChIP 實驗），DNBSEQ 平臺最快交付周期僅需 20 個工作日
解決方案咨詢：根據客戶實際情況提供相關解決方案
性價比高：基于抗體富集目標區域，有效降低測序數據量
測序范圍廣：全基因組范圍內的DNA與蛋白相互作用進行測序分析
關聯分析：可定制 ChIP-Seq 與 RNA-Seq 差異表達基因（DEGs）關聯分析
信息分析
表1 標準信息分析內容
信息分析條款 | 信息分析內容 |
標準信息分析 | 1) 數據基本處理與質控； 2) 基因組測序深度累積分布； 3) Peak 掃描 4) Peak 長度分布 5) Peak 深度分布 6) Peak 在基因功能元件上的分布 7) Peak 相關基因分析 8) Peak 相關基因的 GO 功能顯著性富集分析 9) Peak 相關基因的 Pathway 功能顯著性富集分析 10) 鑒定樣品間差異 Peak 11) 樣品間差異peak在基因功能元件的分布 12) 樣品間差異 peak相關基因 13) 樣品間差異peak 相關基因的 GO 和KEGG富集分析 14) Motif 分析 |
定制化信息分析 | 可結合客戶的需求，協商確定定制化信息分析內容 |
案例一、DNBSEQ 平臺 ChIP-Seq在有絲分裂期間染色質結構動態變化的研究 [1]
案例描述：
在本研究中探索了組蛋白修飾與有絲分裂中的染色質區室化之間的相關性。通過染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）技術，研究人員對缺乏凝縮蛋白的有絲分裂細胞中的活性染色質標記進行了分析，包括 PolII、H3K27ac、H3K36me3 和 H3K4me1。研究發現，在沒有凝縮蛋白的情況下，有絲分裂染色體上完全沒有PolII的存在，排除了轉錄作為有絲分裂區室化驅動力的可能性。在 mA1 區室中，H3K27ac、H3K36me3 和 H3K4me1 的富集程度高于 mA2 區室。特別值得注意的是，與其它兩種標記相比，H3K27ac 在 mA1 和 mA2 之間的差異更為顯著，這表明 H3K27ac 信號強度的差異可能與 mA1 和 mA2 在有絲分裂期間不同的相互作用偏好性有關。
發表單位：深圳灣實驗室
發表期刊：Nature Genetics
影響因子：29.0
研究技術：（DNBSEQ ChIP-Seq）染色質免疫共沉淀測序、Hi-C、CUT&Tag 等。
研究成果：
揭示了有絲分裂染色體在缺乏凝聚素時的基因組折疊原則；
發現了有絲分裂染色體在缺乏凝聚素時的新型區室化模式；
為理解基因組在細胞周期中的動態變化提供了新的視角。
部分研究結果展示：
圖1 ChIP-Seq 分析 RNA PolII、H3K27ac、H3K36me3 和 H3K27me3 在不同狀態的有絲分裂細胞中分布情況
案例二、DNBSEQ 平臺 ChIP-Seq 在植物鹽脅迫研究中的應用[2]
案例描述:
鹽脅迫是限制植物生長和農業生產的一個主要環境因素，全世界超過8億公頃的土地和20%的灌溉土地受土壤鹽分的影響。甲基乙二醛（methylglyoxal, MG）是動物和植物中高度保守的糖酵解副產物，在哺乳動物不同發育過程和疾病、植物對各種脅迫（包括鹽脅迫）的反應中發揮作用。鹽脅迫增加了甲基乙二醛（MG）的積累，但目前尚不清楚MG調控的基因表達是否與表觀遺傳修飾有關。
發表單位：武漢大學
發表期刊：Nucleic Acids Research
影響因子：16.6
研究技術：（DNBSEQ ChIP-Seq）染色質免疫共沉淀測序、（DNBSEQ）RNA-Seq、MNase 染色質可及性檢測等。
研究成果：
MG調節鹽脅迫應答基因的表達；
MG修飾組蛋白H3；
H3甲基乙二醛化與基因表達呈正相關；
H3甲基乙二醛化與鹽脅迫應答基因表達相關；
轉錄因子ABI3和MYC2影響鹽脅迫反應基因H3甲基乙二醛化的特異性分布。
部分結果展示：
圖2 ChIP-Seq分析MMP、H3K4MG、H3K4me1、H3K4me2、 H3K4me3、H3和input
參考文獻：
[1] Zhao H, Lin Y, Lin E,et al. Genome folding principles uncovered in condensin-depleted mitotic chromosomes. Nat Genet. 2024 Jun;56(6):1213-1224.
[2] Zheng-Wei Fu , Jian-Hui Li, et al. The metabolite methylglyoxal-mediated gene expression is associated with histone methylglyoxalation. Nucleic Acids Res. 2021 Feb 26;49(4):1886-1899.
1. 差異 peak 相關基因 GO 富集分析
基因本體論（Gene ontology，GO）是所有物種中最主要的了解基因和基因產物屬性的生物信息學分析手段，GO 分析能夠用于鑒定基因產物的性能，它包含了三類基因功能信息：細胞組分（Cellular Component），分子功能（Molecular Function）和生物學過程(Biological Process）。為了探討表觀遺傳變異在通路和生物學過程中起到的作用，我們對DMR 相關的基因進行了 GO 和 Pathway 分析。
圖1 差異 peak 相關基因的 GO 聚類分析
2. 差異 peak 相關基因 Pathway 富集分析
KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 是有關 Pathway 的主要公共數據庫，該數據庫整合了基因組、化學以及系統功能信息，特別是測序得到的基因集與細胞、生物體以及生態環境的系統性功能相關聯。所有樣品中的 DMR 相關基因均用 KEGG 數據庫進行分析。
圖2 差異 peak 相關基因的 Pathway 功能顯著性富集分析
3. 與 RNA-Seq 關聯分析
圖3 peak proximity scores 與 DEGs 表達差異值關系分布圖
圖4 peak proximity scores 與 DEGs 表達差異值趨勢圖
樣品要求
樣品類型：IP富集DNA樣品，強烈建議同時送對應的Input DNA；
總量：≥ 10 ng ChIPed DNA；
濃度：≥ 1 ng/μL；
純度：OD260/280= 1.8 -2.0；
DNA片段大小：分布在100~500 bp范圍，且主帶明顯。請提供DNA打斷后的檢測膠圖以確定DNA片段大小是否符合要求，并請附加一份詳細的樣品信息單并提供ChIP后的q-PCR驗證結果；
Q1：DNBSEQ平臺的測序原理是什么？
DNBSEQ采用優化的聯合探針錨定聚合技術（cPAS）和改進的DNA納米球（DNB）核心測序技術，是行業領先的高通量測序平臺之一。具體而言，首先DNA分子錨和熒光探針在納米球上進行聚合，隨后高分辨率成像系統對光信號進行采集，光信號經過數字化處理后即可獲得待測序列。其中，DNB通過線性擴增增強信號，降低單拷貝的錯誤率。此外，DNB大小與芯片上活性位點的大小相匹配，每個位點結合一個DNA納米球，在保證測序精度的情況下提高了測序芯片的利用效率。
Q2：DNBSEQ ChIP-Seq產品優勢是什么？
a)
準確性高：高深度Peaks與HiSeq平臺一致性高達到100%
b) 起始量低：樣品起始量低至5ng
c) 周期更短：交付快至20個工作日
d) 性價比高：相同的測序質量，價格更優惠
e) 關聯分析：ChIP-Seq與RNA-Seq差異表達基因（DEGs）關聯分析
Q3：對樣本起始量有沒有要求？
建庫起始量為5ng，建議ChIP-ed DNA≥ 20ng，低于5ng也可以做，之前有做過無濃度樣本成功的案例，但這類項目只能客戶自己承擔建庫風險。
Q4：測序策略是什么？
SE50
Q5： ChIP-Seq的對照中input和IgG有什么不同嗎？
Input對照：在進行免疫沉淀前，需要取一部分斷裂后的染色質做Input對照。Input是斷裂后的基因組DNA，不加抗體做富集，但是需要與沉淀后的樣品DNA一起經過逆轉交聯，DNA純化，以及最后的PCR或其他方法檢測。Input對照不僅可以驗證染色質斷裂的效果，還可以根據Input中的靶序列的含量以及染色質沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對照是ChIP實驗必不可少的步驟。
陰性對照：用普通的IgG做為抗體（目的蛋白抗體宿主的IgG或血清）。理論上不會ChIP下來任何DNA片段，因此作為陰性對照，但是由于非特異結合，或者實驗過程中，沒發生結合的DNA清除不完全，可能也會出現條帶，如果非常明顯，那就證明實驗過程有待改進。
Q6：推薦多少數據量？能否接不同數據量的項目？
DNBSEQ ChIP-Seq推薦20M clean reads/樣本，其他類型數據量也可提供。
Q7：N-ChIP和X-ChIP的區別是什么？
N-ChIP基于核酸內切酶MNase酶切，切割核小體且作用溫和，較適用于組蛋白修飾研究；X-ChIP基于甲醛固定，超聲打斷，適用于大多數蛋白-DNA相互作用研究。
Q8：樣品制備過程是否需要PCR擴增？PCR擴增后是否會影響最后的結果？
基于第二代測序平臺的ChIP-Seq在樣品制備過程中需要進行PCR，但是只需要非常少的反應次數，由于PCR引起的偏向性非常小。另外，在測序結果出來后，針對reads的比對結果，通過信息分析手段可以去除duplication的影響。我們的所有信息分析結果都是在去除duplication之后進行生物學意義挖掘的。根據我們的經驗，如果您送的樣品是直接ChIP富集的DNA，在我們的樣品制備后出現duplication的reads比例不會超過全部reads產量的5%。如果您送的樣品在ChIP富集后有做過PCR擴增，那么這一步的PCR對結果的duplication影響非常嚴重。
Q9：哪些因素會影響ChIP-Seq的結果？
抗體的質量與特異性、需要富集的目標區域在基因組上的比例、ChIP的實驗操作、DNA片段長度范圍等都會影響ChIP-Seq的結果。
