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真核鏈特異性轉錄組測序
轉錄組測序，對某一物種或特定細胞在某一功能狀態下產生的mRNA進行高通量測序，既可以提供定量分析，檢測基因表達水平差異，又可以提供結構分析，能發現稀有轉錄本，精確地識別可變剪切位點、基因融合等，而且不依賴于參考基因組。
技術優勢
1.鏈特異性文庫：能檢測反義鏈表達，比對率更高，定量更準確，注釋、可變剪切和基因融合等結果更可靠；
2.樣品起始量低：人鼠樣本起始量僅需200 ng；可微量定制化建庫，低至200 pg；可單細胞定制化建庫，低至單個細胞；
3.高質量的自主測序平臺：DNBSEQ測序技術具有滾環復制擴增帶來的錯誤累積低和規則陣列載片帶來的信號密度高等原理性優勢，大幅提高了測序的準確性；而且，基于DNBSEQ測序平臺的產出數據重復序列率低(Dup率低)、有效數據利用率高、標簽跳躍少（Index hopping少），能有效降低“張冠李戴”的情況。
4.Dr. Tom系統：無需生信分析基礎，多數據庫聯合分析，多維度數據展示，循環挖掘數據，輕松自主做個性化分析。
5.提供針對微量樣本以及降解樣本等多類型樣本的不同建庫技術方案，以滿足不同的科研需求。
產品應用
醫學上的應用方向——
農學上的應用方向 ——
研究內容
一、無參考序列物種
標準信息分析：
1. 測序數據過濾；
2. 轉錄組de novo組裝；
3. Unigene七大功能數據庫注釋；
4. Unigene的CDS預測；
5. Unigene的TF編碼能力預測；
6. Unigene的SSR檢測；
7. Unigene表達量計算；
8. 時間序列分析；
9. 差異表達基因檢測；
10. 差異表達基因聚類分析；
11. 差異表達基因GO功能分析；
12. 差異表達基因Pathway功能分析；
13. 差異基因蛋白互作分析；
14. 植物抗病基因預測（植物樣本）。
定制化信息分析：
1. 可結合客戶的需求，協商確定定制化信息分析內容。
二、有參考序列物種
標準信息分析：
1. 基本數據統計① 去除接頭序列、低質量序列得到reads信息，② 樣品相關性，③ 表達量分布，④ RNA分類；
2. 參考基因組比對；
3. mRNA鑒定；
4. mRNA定量分析；
5. mRNA差異表達分析（樣本間、組間）；
6. mRNA表達/差異基因聚類；
7. mRNA差異基因GO分類、富集；
8. mRNA差異基因KEGG分類、富集；
9. mRNA結構分析：可變剪切分析；
10. mRNA結構分析：融合基因分析。
Dr.Tom信息分析：
一）數據庫注釋
1. 轉錄因子注釋（AnimalTFDB/PlantTFDB）；
2. GSEA分析；
3. Rfam、Pfam、Reactome、COG、EggNOG和InterPro數據庫注釋；
二）互作網絡分析
1. 靶基因分析① miRNA-mRNA靶向關系分析，② lncRNA-mRNA靶向關系分析；
2. ceRNA互作網絡分析；
3. 蛋白互作網絡分析；
4. 共表達互作網絡分析；
三）特色分析
1. 自定義標簽和自有數據上傳；
2. 外部數據庫信息（TCGA、ARCHS4）；
3. 關鍵驅動基因網絡圖分析；
4. 時間序列分析。
（*以上分析內容為部分物種可做。）
定制化信息分析 ：
1. 可結合客戶的需求，協商確定定制化信息分析內容
案例一 RAF樣蛋白激酶介導一種高度保守且快速的生長素反應
文章題目：RAF-like protein kinases mediate a deeply conserved, rapid auxin response
發表期刊：Cell
影響因子：45.5
發表時間：2024年1月
發表單位：瓦赫寧根大學、查理大學、奧地利科學技術研究所、京都大學、東京理科大學
案例描述：該研究團隊鑒定了一種對生長素快速全蛋白質組磷酸化的反應。這種反應發生在5種陸地植物和藻類物種上，并集中于一組核心的共同靶點。該研究鑒定出了這種生長素觸發的跨物種磷酸化的中心介質是纖維肉瘤（RAF) 樣蛋白激酶，遺傳分析該激酶與生長素觸發的蛋白質磷酸化和快速細胞反應聯系起來，從而確定了綠色譜系中生長素快速反應的古老機制。
參考文獻：Kuhn A, Roosjen M, Mutte S, Dubey SM, Carrillo Carrasco VP, Boeren S, Monzer A, Koehorst J, Kohchi T, Nishihama R, Fendrych M, Sprakel J, Friml J, Weijers D. RAF-like protein kinases mediate a deeply conserved, rapid auxin response. Cell. 2024 Jan
案例二 全球最大規模結直腸癌多組學研究
文章題目：Prognostic genome and transcriptome signatures in colorectal cancers
發表期刊：Nature
影響因子：50.5
發表時間：2024年8月
發表單位：中國科學院杭州醫學研究所、瑞典烏普薩拉大學（Uppsala University）、華大生命科學研究院、華大基因智惠醫學研究院
文章簡述：該研究實現了迄今為止最大規模的結直腸癌基因組和轉錄組的綜合分析，并將分子層面的發現與高質量的臨床數據相結合，從而識別關鍵預后因子，這使這項研究有別于其他絕大多數癌癥基因組學的研究。
研究結果：基于華大基因DNBSEQ測序平臺，對瑞典U-CAN隊列（Uppsala/Ume? Comprehensive Cancer Consortium）中的1,063例結直腸癌樣本進行全基因組和轉錄組測序分析，鑒定得到了96個顯著突變基因，其中，有24個為新發現的潛在驅動基因，并發現與WNT、EGFR和TGF-β通路相關的驅動基因和結直腸癌生存顯著相關。利用突變時序分析，推導出9個與癌癥發生早期事件相關的驅動突變基因和更傾向于在癌癥發生后期階段出現的突變基因。
這些發現為結直腸癌的早期檢測和靶向治療提供了臨床研究策略，并揭示了與腫瘤后期侵襲和轉移相關的重要分子變化。整合基因組和轉錄組數據的分子分型能得到更精細準確的患者預后分層，這對優化臨床腫瘤分型、指導結直腸癌精準治療具有重要意義，新構建的表達譜精細分型將在未來指導結直腸癌個體化診療中發揮重要作用。
參考文獻：Nunes, L., Li, F., Wu, M. et al. Prognostic genome and transcriptome signatures in colorectal cancers. Nature (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07769-3
部分內容展示：
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圖1? 差異聚類熱圖
圖2? 功能富集或分類圖
圖3??蛋白互作網絡
表1 真核轉錄組測序核酸樣品判定標準
真核轉錄組（默認鏈特異性，非鏈特異和鏈特異性送樣建議相同） | |||||||
樣本類型 | 總量 | 濃度 | 完整性 | 28S/18S | 基線和5S | 純度 | |
分析儀 檢測 | 電泳檢測 | ||||||
Total RNA (真菌) | 1 μg | 20-1,000 ng/μL | RIN≥6.0 | RNA條帶清晰無彌散或拖尾 | 28S/18S≥1.0 | 基線平整，5S峰正常 | 無 DNA， 蛋白/鹽離子等污染， 樣本無色透明， 不粘稠 |
Total RNA (植物) | 400 ng | 10-1,000 ng/μL | RIN≥6.0 | 28S/18S≥1.0 | |||
Total RNA (其他動物) | 400 ng | 10-1,000 ng/μL | RIN≥6.0 | 28S/18S≥1.0 | |||
Total RNA (非全血人鼠) | 200 ng | 5-1,000 ng/μL | RIN≥6.0 | 28S/18S≥1.0 | |||
Total RNA (人鼠細胞系) | 200 ng | 5-1,000 ng/μL | RIN≥7.0 | 28S/18S≥1.0 | |||
Total RNA (昆蟲) | 400 ng | 10-1,000 ng/μL | RIN≥6.0 | NA | |||
表2 真核轉錄組測序組織樣品判定標準
組織類型 | 真核轉錄組文庫 |
新鮮培養細胞 (細胞數) | ≥2×105 cells |
新鮮動物組織干重 | ≥25 mg |
新鮮植物組織干重 | 嫩葉、嫩莖≥50mg 根、果實、種子、花等≥100mg |
菌體（細胞數或干重） | ≥5×106 cells 或 ≥20 mg |
全血-哺乳動物 | ≥1 mL 全血分離的白細胞 或≥1 mL PAXgene? Blood RNA Tube 收集的全血 或≥0.3mL 全血＋3 倍體積 TRIzol裂解液 |
全血-非哺乳動物 | ≥0.1 mL 全血分離的白細胞 或≥0.1 mL 全血＋6倍體積 TRIzol 裂解液 |
FFPE | ≥5片， 未染色， 組織面積≥100 mm2， 切片厚度5~10 μm |
1、DNBSEQ滾環擴增技術的特點是什么？
答：滾環擴增技術RCA的模板始終是同段序列，擴增錯誤不會累積，與PCR指數擴增相比具有保真優勢。
2、DNBSEQ下機數據格式是怎么樣的？
答：通用下機數據格式：（FASTQ）讓數據兼容性更好。
3、DNBSEQ平臺真核轉錄組推薦數據量？
答：推薦6Gb以上；
4、可否提供DNBSEQ轉錄組標準品測試數據供客戶測評？
答：可以，我們1個UHRR標準品，構建了3個文庫，測序數據可在EBI網站（http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB19428）下載。
5、鏈特異性文庫與非鏈特異性文庫建庫主要區別是什么，鏈特異性文庫的優勢是什么？
答：鏈特異性文庫的構建與非鏈特異性文庫不同點在于：鏈特異性文庫在cDNA二鏈的合成步驟，使用dUTP代替dTTP；
鏈特異性文庫的優勢是1）能檢測反義鏈表達2）更精確地定量重疊的轉錄本 3）增強轉錄本注釋的可信度4）提高比對率 5）檢測可變剪切轉錄本、基因融合和等位基因特異性表達可信度高[3-7]。
6、鏈特異性文庫與非鏈特異性文庫在樣品要求、推薦數據量和分析條款上有什么不同？
答：兩者在這三方面是一樣的。但是雖然分析條款是一樣的，基因組比對和基因表達定量分析的參數上略有不同。所以在信息分析前（包括de novo和resequencing），生信人員需要根據建庫方法（鏈特異性文庫/非鏈特異性文庫），來設置正確的分析參數；鏈特異文庫堿基會根據樣本實際ATCG含量，呈現不等分離，屬于正常結果。
