案例一：HIT-ISOseq揭示生菜組織特異性轉(zhuǎn)錄組圖譜[1]

發(fā)表雜志：Communications Biology（IF=5.2）      

發(fā)表時間： 2024-7-31

方案設計：

• 研究背景：生菜是全球種植和消費最廣泛的雙子葉蔬菜之一。盡管已有生菜的參考基因組序列，但其基因注釋仍不完整，阻礙了基因組資源的全面研究和廣泛應用。
• 研究材料及方法：研究隨機選取 6 株成熟生菜植株，分為 2 個生物學重復組，每組 3 株。用超純水清洗 3 次后，分別切成根、莖、葉 3 部分，進行 DNBSEQ 轉(zhuǎn)錄組測序以及多倍通量全長轉(zhuǎn)錄組測序（HIT-ISOseq）。

主要發(fā)現(xiàn)：

1)     HIT-ISOseq 改進生菜的參考轉(zhuǎn)錄本注釋和功能注釋

       利用 PacBio Sequel II SMRT Cell 8 M 測序芯片共獲得 15.79 M reads，平均每個 CCS reads 有 3.46 個全長非嵌合序列（FLNC）。每個樣本平均獲得 2.55 M 到 2.74 M FLNC reads，平均讀長范圍從 736.31 bp到 779.97 bp。HIT-ISOseq 測序結(jié)果共鑒定出 31,297 個基因和 69,973 個轉(zhuǎn)錄本，每個樣本的基因數(shù)量為 23,550 至 27,629 個，轉(zhuǎn)錄本數(shù)量為 54,711 至 58,998 個。

2)     定量一致性結(jié)果

       從 HIT-ISOseq 測序數(shù)據(jù)得出的基因和轉(zhuǎn)錄本表達與 DNBSEQ (PE150) 測序獲得的結(jié)果具有高度相關性，從而驗證了基因表達定量的一致性。

圖1 HIT-ISOseq 更新生菜參考注釋

3) HIT-ISOseq 揭示生菜中組織特異性表達基因及轉(zhuǎn)錄本

       通過 HIT-ISOseq 測序數(shù)據(jù)鑒定到生菜中組織特異性表達的 2,611 個基因以及 4,842 個轉(zhuǎn)錄本。此外，研究者鑒定到 18 種表現(xiàn)出與相應基因表達模式不同的轉(zhuǎn)錄本，并對這些轉(zhuǎn)錄本進行了 qPCR 驗證。

圖2 HIT-ISOseq 揭示生菜中組織特異性表達基因

案例二：Poly(A)長度控制對精子發(fā)生過程中轉(zhuǎn)錄與翻譯的調(diào)控作用[2]

發(fā)表雜志：Development（IF=6.862）                        

發(fā)表時間： 2022-6-15

研究方法：poly(A) 全長轉(zhuǎn)錄組測序、Ribo-seq

主要結(jié)論：

       為探究精子細胞分化過程中 Poly(A) 長度動態(tài)變化與 mRNA 穩(wěn)定性和翻譯延遲的關系，作者通過構(gòu)建 PAPA-seq 文庫，使用 Poly(U) 聚合酶將 G、I 核苷酸加入到 mRNA 的 3′ 端，并進行反轉(zhuǎn)錄生成含有全長 Poly(A) 尾的 cDNA，使用 PacBio 平臺測序檢測精子發(fā)生過程中粗線期精母細胞（pachytene spermatocytes）、圓形（round）和長形精子細胞（elongating spermatids）以及精子的 Poly(A) 長度及 3’ UTR 長度變化（如圖3）；

       PAPA-seq 結(jié)果顯示，當粗線期精母細胞發(fā)育成圓形和長形精子細胞時，轉(zhuǎn)錄本全長呈縮短趨勢，且 mRNAs 的 3’ UTRs 及 5’ UTRs 逐漸縮短。但 Poly(A) 長度則呈雙相方式動態(tài)變化，從粗線期精母細胞到圓形精子細胞，Poly(A) 尾長度逐漸增加，這可能有助于延長 mRNA 半衰期，并在精子發(fā)生后期保護 mRNAs 以延遲翻譯。相反，從圓形精子到長形精子過程中，Poly(A) 的長度逐漸變短，表明轉(zhuǎn)錄本 Poly(A) 長度變化與精子發(fā)生過程中的翻譯延遲同步。

圖3 Poly(A) 全長轉(zhuǎn)錄組深度測序顯示精子發(fā)生過程中的 Poly(A) 長度動態(tài)變化

       為了進一步探討 Poly(A) 長度對 mRNA 翻譯抑制和激活的影響，研究團隊通過 PAPA-seq，發(fā)現(xiàn)定位在 RNP 的 mRNAs 的平均 Poly(A) 長度僅為定位在含多核糖體中（polysome）mRNA 的 1/40，這表明 mRNA 的去腺苷酸化與其在 RNPs 的定位之間存在強烈的關聯(lián)。通過分析 RNP和 polysome 中的 miRNA-mRNA 靶向關系發(fā)現(xiàn)，在粗線期精母細胞中，與 polysome 轉(zhuǎn)錄本相比，RNP 富集型轉(zhuǎn)錄本中的 miRNA 靶點更集中在 3'端，精子發(fā)生進展到圓形和長形精子細胞階段時，目標轉(zhuǎn)錄本 3' UTRs 上的 miRNA 靶點逐漸減少并最終消失，這與長形精子細胞中 RNP 的 mRNAs 釋放相一致，表明 miRNAs 驅(qū)動 mRNAs 進入 RNPs 進行去腺苷酸化。具有較長的 Poly(A) 尾（>50 nt）的轉(zhuǎn)錄本從 RNP 組分轉(zhuǎn)移到 polysome 組分，而具有較短的 Poly(A) 尾（<5 nt）的轉(zhuǎn)錄本往往被隔離在核糖核蛋白（RNP）顆粒中，以進行翻譯抑制并保持穩(wěn)定。

       并且，通過 Drosha 條件敲除（cKO）小鼠模型及 miR-506 基因敲除（KO）小鼠系實驗以消除 miRNA 的產(chǎn)生，驗證 miRNA 通過去腺苷酸化縮短其靶 mRNA 的 Poly(A)長度，從而將它們隔離在 RNP 顆粒中以延遲翻譯。

圖4 miRNA 缺失對 RNP 顆粒和多核糖體組分中 Poly(A) 長度分布的影響

參考文獻：

[1] Shi, ZX., Xiang, L., Zhao, HM. et al. High-throughput single-molecule long-read RNA sequencing analysis of tissue-specific genes and isoforms in lettuce (Lactuca sativa L.). Commun Biol 7, 920 (2024). https://doi.org/10.1038/s42003-024-06598-4.

[2] Guo, Mei et al. “Uncoupling transcription and translation through miRNA-dependent poly(A) length control in haploid male germ cells.” Development (Cambridge, England) vol. 149,12 (2022): dev199573. doi:10.1242/dev.199573.

多倍通量全長轉(zhuǎn)錄組

       為了充分利用 PacBio 測序長讀長優(yōu)勢，華大科技研發(fā)了多倍通量全長轉(zhuǎn)錄組專利技術(shù)，在建庫過程中將多個轉(zhuǎn)錄本首尾相連構(gòu)建多倍通量文庫；通過 CCS 測序，一條 CCS read 可拆分得到多條轉(zhuǎn)錄本，大幅提升 RacBio 測序全長 reads 的獲得率。

圖1 多倍通量全長轉(zhuǎn)錄組建庫示意圖

技術(shù)優(yōu)勢

       多倍通量全長轉(zhuǎn)錄組將單個 cell 的有效 reads 數(shù)提升至 3-6 倍以上；在成本不變的情況下，可得到更多的轉(zhuǎn)錄本檢測數(shù)目；并結(jié)合 UMI 實現(xiàn)準確的基因/轉(zhuǎn)錄本定量。

1） 有效 reads 數(shù)提升 3-6 倍

       同樣的測序數(shù)據(jù)量，多倍通量全長轉(zhuǎn)錄組檢測到的 reads 數(shù)是常規(guī)全長轉(zhuǎn)錄組的 3-6 倍。

2） 測序準確度高——基因結(jié)構(gòu)分析

       多倍通量全長轉(zhuǎn)錄組測序，使用 PacBio 測序平臺 CCS 測序模式，測序準確性較高。同一序列 CCS 測序得到的 full-pass 數(shù)會減少，但 Isoform 校正過程中可用的 reads 數(shù)會增加，最終得到的序列準確度并不會降低，適用于轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)分析。

       各物種的轉(zhuǎn)錄本多樣且復雜，絕大多數(shù)真核生物基因都存在多種剪切形式，全長轉(zhuǎn)錄組無需打斷直接讀取從 5' 端到 3' 端的序列，可有效識別可變剪接（AS）、可選擇性多聚腺苷酸化（APA）、基因家族、融合基因等，是基因結(jié)構(gòu)分析的有效方式。

3） UMI 和多倍通量完美結(jié)合，基因定量結(jié)果更準確

       UMI（Unique molecular identifier，特異性分子標識符）和多倍通量完美結(jié)合，基因定量結(jié)果和短讀長平臺一致性好，測序結(jié)果也可以做基因定量。

圖2 基因定量一致性（spearman）

產(chǎn)品策略

建庫：構(gòu)建多倍通量全長轉(zhuǎn)錄組文庫；

測序：利用 Revio 平臺進行 CCS 測序，推薦測序 5M s-reads 數(shù)據(jù)量以上；

分析：根據(jù)有無參考基因組分為 Ref（有參)和 de novo（無參）分析。

表1. 測序數(shù)據(jù)量推薦

Poly(A) 全長轉(zhuǎn)錄組

       華大科技 poly(A)+ 全長轉(zhuǎn)錄組測序，基于 PacBio 長讀長測序平臺，可同時得到高準確度的全長轉(zhuǎn)錄本序列和 poly(A) 長度及堿基情況。測序數(shù)據(jù)除可用于分析可變剪接、融合基因、鑒定新異構(gòu)體，精確定量轉(zhuǎn)錄本表達水平之外，更能全面檢測 Poly(A) 長度和堿基類型。

       助您深入研究 Poly(A) 在轉(zhuǎn)錄本表達中的調(diào)控作用，從 RNA 整體水平上研究 poly(A) 長度與轉(zhuǎn)錄本及非編碼區(qū)的關系，實現(xiàn)從結(jié)果（基因表達量，結(jié)構(gòu)變異）到原因（poly(A)調(diào)控機制）的全方位研究！

圖3 poly(A) 全長轉(zhuǎn)錄組建庫方法示意圖

Poly(A)+ 全長轉(zhuǎn)錄組特色分析

圖4 所有樣品的 poly(A) 長度分布圖

圖5 各樣本 poly(A) 長度分布圖

圖6 poly(A) 非 A 堿基含量圖

圖7 poly(A) 長度與轉(zhuǎn)錄本表達量的關系圖

RNA樣本送樣建議

PacBio全長轉(zhuǎn)錄組

組織樣本送樣建議

Q1：多倍通量全長轉(zhuǎn)錄組測序會不會影響轉(zhuǎn)錄本長度分布？

A1：不會。

       多倍通量全長轉(zhuǎn)錄組技術(shù)將不同長度的轉(zhuǎn)錄本隨機連接，無長度偏向性，可無差異檢測到各個長度范圍的轉(zhuǎn)錄本。如下圖所示，和常規(guī)文庫相比，多倍通量全長轉(zhuǎn)錄組文庫的檢測結(jié)果并無明顯偏向性。

圖1 全長轉(zhuǎn)錄本長度分布圖

Q2：多倍通量全長轉(zhuǎn)錄組技術(shù)得到的reads準確度是否會降低？

A2: 不會。

       測序長度越長，CCS 后單條序列準確度越高。PacBio 測序中構(gòu)建啞鈴型文庫，在插入片段比酶讀長短的情況下，通過環(huán)形比對測序（Circular Consensus Sequencing, CCS），同一個片段可以被循環(huán)測到很多次，這在很大程度增加最終得到的序列準確性。

圖2 CCS 測序示意圖。

       分析過程中，通過 reads 聚類和 Isoform 校正進一步提升 Isoform 準確度。在 PacBio 數(shù)據(jù)分析中，為了提高最終得到的轉(zhuǎn)錄本序列的準確度，得到 CCS 序列之后會進行 reads 聚類和 Isoform 校正，進一步提高 Isoform 準確度，同一 Isoform 測到的條數(shù)越多，校正后的準確度越高。這一步可以通過閾值設定，篩選準確度達到要求的用于后續(xù)分析，目前一般將 Isoform 校正后準確度在 0.99 以上判定為高質(zhì)量 Isoform。

圖3 Isoform校正過程示意圖。

       多倍通量全長轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)品，同一序列 CCS 測序得到的 full-pass 數(shù)會減少，但 Isoform 校正過程中可用的 reads 數(shù)會相應增加，最終得到的序列準確度并不會降低。

Q3：多倍通量全長轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)品能不能用來做基因/轉(zhuǎn)錄本定量？

A3：可以

       多倍通量全長轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)品結(jié)合了多倍通量和另外一項華大特有技術(shù)（UMI），在提高有效數(shù)據(jù)量的同時通過 UMI 對每一條轉(zhuǎn)錄本分子進行標記，可以排除建庫過程的 PCR 偏向性，定量結(jié)果可達到和短讀長平臺基因定量相當?shù)乃健?/font>

Q4：多倍通量全長轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)品需要構(gòu)建多個文庫嗎？

A4：不需要。

       多倍通量全長轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在構(gòu)建啞鈴型文庫之前，將不同長度的轉(zhuǎn)錄本進行隨機連接，并通過篩選得到有效連接產(chǎn)物，測序 loading 偏差小。

Q5：全長轉(zhuǎn)錄組目前能接原核轉(zhuǎn)錄組嗎？

A5： 不能。目前全長轉(zhuǎn)錄組主要針對真核轉(zhuǎn)錄組，如果需要做原核轉(zhuǎn)錄組或 LncRNA，需個性化溝通。