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環狀RNA測序
環狀RNA（circRNA）是一類特殊的非編碼RNA分子，與傳統的線性RNA（linear RNA）不同，circRNA分子合呈封閉環狀結構，且不受RNA外切酶影響，表達更穩定，不易降解。華大推出環狀RNA高通量測序服務，可進行環狀RNA的鑒定以及環狀RNA與miRNA‘’海綿效應‘’分析， 可實現ceRNA（competing endogenous RNAs，內源競爭RNA）機制等研究。可應用在物種環狀RNA表達譜構建，環狀RNA疾病生物標記開發，環狀RNA作用機制研究等方面。
技術優勢
信息分析內容
一、標準信息分析
1. 數據處理：
1.1 對原始數據進行去除接頭和低質量 reads 的處理
1.2 測序質量評估
1.3 過濾核糖體 RNA
1.4 參考基因組比對
2. CircRNA 預測及注釋
3. CircRNA 外顯子及可變剪切
4. CircRNA 來源基因鑒定
5. CircRNA 表達定量
5.1 CircRNA 定量分析
5.2 樣品相關性分析
5.3 樣品間共有表達基因及特異表達基因維恩圖
5.4 樣品間 CircRNA 表達量聚類
6. 差異表達 CircRNA 檢測
7. 差異表達 CircRNA 聚類分析
8. 差異表達 CircRNA 聚類分析
二、高級信息分析
1. 差異 CircRNA 來源基因 GO 功能分析
2. 差異 CircRNA 來源基因 Pathway 功能分析
3. miRNA 靶向環狀 RNA 預測
華大circRNA研究——環狀RNA circβ-catenin的翻譯通過激活Wnt通路促進肝癌細胞生長
Translation of the circular RNA circβ-catenin promotes liver cancer cell growth through activation of the Wnt pathway. Genome Biol 20, 84 (2019).
研究概要：
目前肝癌是一個全球性健康問題，在過去的幾十年里有許多信號通路被證實參與了肝癌的發生，Wnt/catenin通路作為一種高度保守的通路，廣泛參與多種病理事件。在本研究中，本次研究利用在線數據庫中的RNA測序數據進行分析，確定了一個來自于catenin基因的circRNA，命名為“circβ-catenin”。功能研究表明，敲除circβ-catenin可抑制體內和體外癌細胞的生長。隨后的研究表明，circβ-catenin編碼一種新的370個氨基酸的β-catenin同工型。該同工型保護β-catenin免受GSK3β介導的降解，從而增強Wnt /β-catenin途徑的激活。
研究結果：
1. 人細胞系中WNT通路相關環狀RNA的生物學分析以及circβ-catenin在人細胞系和組織中的表達
研究人員計算了7個非癌細胞系和6個癌細胞系中Wnt通路相關環狀RNA的數量，發現大多數可以產生數百個Wnt通路相關環狀rna。接下來重點關注HepG2細胞系的肝臟來源。發現48個Wnt通路相關基因在HepG2細胞中產生131個環狀RNA。通過使用cDNA樣本中的發散引物和Sanger測序，證實了頭尾剪接(back-splicing)發生在catenin的外顯子中。然后設計了收斂型和發散型引物，分別檢測線β-catenin mRNA 和環狀circβ-catenin。結果提示circβ-catenin比其線性同源β-catenin mRNA更穩定。還進行了Northern blotting檢測circβ-catenin和線性β-catenin mRNA的RNA水平。還檢查了circβ-catenin蛋白和β-catenin mRNA在不同人體組織中的表達譜，發現circβ-catenin表達與組織中的線性的β-catenin mRNA呈正相關。
圖1. circβ-catenin 在人細胞系和組織中的表達
2. circβ-catenin的敲低抑制腫瘤的生長和轉移
為了評估circβ-catenin的生物學重要性，分析了circβ-catenin在肝癌組織中的表達，發現circβ-catenin在肝癌組織中顯著升高，針對circβ-catenin的shRNA病毒載體沉默了兩種肝癌細胞系中circβ-catenin的RNA水平。然而circβ-catenin的敲除并不影響β-catenin mRNA的表達水平。MTT檢測，集落形成檢測和流式細胞術檢測表明，circβ-catenin的沉默新住抑制了肝癌細胞的生長和細胞周期進展，愈合實驗顯示，circβ-catenin的沉默抑制了癌細胞的遷移。侵襲實驗表明，circβ-catenin的沉默也會損害細胞的侵襲能力，挽救實驗表明circβ-catenin的異位表達可以挽救shRNA介導的表型。
圖2. circβ-catenin的敲低體外肝癌細胞的增殖和轉移
3. circβ-catenin的沉默抑制了Wnt/β-catenin的通路
為了闡明circβ-catenin在肝癌中的潛在的分子機制，分析了敲除circβ-catenin后的全部RNA的表達譜。RNA-seq的數據的生物信息學分析顯示，受circβ-catenin影響的基因在Wnt/catenin通路中顯著富集。也通過RT-PCR進行了數據驗證。研究人員合成了針對circβ-catenin或β-catenin mRNA的不同siRNA的siRNA, 盡管siRNA不會影響β-catenin的mRNA水平，但是顯著降低了β-catenin的蛋白水平。隨后的研究表明，靶向circβ-catenin的siRNA可以顯著降低帶有β-catenin結合位點的TOPflash載體的熒光素酶活性，而不會改變具有突變的β-catenin結合位點的FOPflash載體的熒光素酶活性。
圖3. circβ-catenin的敲低抑制了Wnt/β-catenin的通路
CircRNA biomarker鑒定——來自ANXA2基因轉錄的環狀RNA可作為神經性多發性硬化癥診斷的biomarker
Circular RNA profiling reveals that circular RNAs from ANXA2 can be used as new biomarkers for multiple sclerosis[J]. Human Molecular Genetics, 2017
發表單位：西班牙Biodonostia健康研究中心等
研究摘要
為尋找多發性硬化癥（MS）患病診斷的biomarker，本次采用患病組和對照組各選4個血液白細胞樣本進行研究，在406個差異表達環狀RNA中找到2個目標環狀RNA：circ_0005402和circ_0035560，在20個患病RR-MS個體中和18個正常人中進行驗證，使用The Wilcoxon test證實這兩個環狀RNA在患病中顯著低表達。并通過ROC 生存曲線分析：circ_0005402、circ_0035560 敏感性和特異性較高，可作為潛在的臨床患病診斷的biomarker。
部分研究結果展示
1、共發現406個差異表達環狀RNA，其中324低表達，82高表達；通過qPCR驗證10個差異表達環狀RNA, 其中5個高表達，5個低表達，其中驗證率為90%。
圖1 多發性硬化癥環狀RNA差異分析，a：差異環狀RNA火山圖分析；b：差異環狀RNA聚類圖分析；c：qPCR驗證結果
2、通過ROC生存分析，結果顯示來自ANXA1-mRNA, circ_0003452_2 和circ_0005402具有較高敏感度，可作為潛在診斷的biomarker。
圖2 ANXA1-mRNA, circ_0003452_2 and circ_0005402 ROC生存曲線分析
圖1 circRNA數目在基因組上的分布圖
外圈表示染色體，內圈表示以1,000,000個堿基為滑動窗口時，circRNA數目在染色體上的變化。
圖2 差異circRNA的表達量熱圖
X軸代表聚類分析的樣品，Y軸代表差異circRNA。顏色代表log10轉換后的表達量（顏色越深表示表達量越高，越淺表示表達量越低）。
圖3 上、下調circRNA的來源基因GO功能分類統計圖
X軸代表GO功能分類，Y軸表示對應 GO Term 中上、下調circRNA來源基因的數目。
表1 CircRNA組織樣品送樣建議
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組織類型 |
具體要求 |
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新鮮培養細胞（細胞數） |
≥1×106
cells |
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新鮮動物組織干重 |
≥50 mg |
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新鮮植物組織干重 |
≥200 mg |
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全血（哺乳動物） |
≥2.5 mL 全血分離的白細胞或 ≥1 mL
PAXgene? Blood RNA Tube收集的全血 |
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FFPE |
≥5片，未染色，100 mm2，5-10 μm厚度 |
表2 CircRNA測序樣品判定標準
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樣本類型 |
總量 |
體積 |
濃度 |
RIN |
28S/18S |
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Total RNA (Plant) |
≥2μg |
≥15μL |
≥40 ng/μL |
RIN≥6 |
28S/18S≥1.0 |
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Total RNA (Animal) |
≥2μg |
≥15μL |
≥40 ng/μL |
RIN≥7.0 |
28S/18S≥1.0 |
*備注：
（1）基線和5S：基線平整，5S 峰正常
（2）純度：無 DNA，蛋白/ 鹽離子等污染， 樣本無色透明 不粘稠
Q1：Total RNA最低送樣量是多少？
2 μg/單次，詳細可見上面的送樣建議。
Q2：環狀RNA 推薦數據量？
根據飽和度分析，一般推薦10 G以上數據。
Q3：circRNA需要做生物學重復嗎？
需要。至少3個，實際越多越好。
Q4：lncRNA數據分析和環狀RNA標準建庫流程（R酶富集方法）分析的結果有什么區別？
LncRNA數據（10 G clean data）鑒定到1千到2千個環狀RNA，數量級在千位；而富集方法可鑒定到2萬-3萬個環狀RNA，數據量級在萬位；兩種方式可根據客戶研究目的和需求進行針對性推薦，如客戶初期研究，可進行lncRNA建庫測序方法，具有較高性價比；如果是針對性的研究環狀RNA，可推薦環狀RNA標準建庫方法。
Q5：環狀RNA驗證方法？
定量驗證：根據junction位點設計引物進行qPCR驗證；
功能驗證：使用circRIP方法驗證miRNA Sponge功能；使用miRNA敲除及拮抗等模擬物進行功能驗證。
Q6：環狀RNA（circRNA）是不是很穩定、不存在降解？
CircRNA即為成環的RNA分子，其特性即是不易被RNase R降解。但是，實際上，降解分兩種，一種是RNase R的降解，一種是水解。水解是不區分環狀或者非環狀的過程，并且事實上環狀更容易被水解，因為環狀的堿基基團靠的近，羥基更容易去攻擊磷酸羥基鍵。將circRNA放在室溫或者60℃或者在鎂離子作用下，它們依然較容易被水解。在使用RNase R降解的過程中，體系中含有鎂離子（Mg2+），因此實際的操作過程可能存在對circRNA的水解。所以，RNase R降解法獲得circRNA的這種操作，可以提高檢測的敏感性，但是不能提高特異性。
Q7：如何預測circRNA？
因為在circRNA純化收集的過程中，需要去除核糖體RNA和線性RNA，然后打斷成片段進行建庫測序。在得到測序結果后，我們需要對circRNA進行預測鑒定。由于circRNA頭尾相接易環化，如果測序結果能獲得接頭序列（Jumping Sequence），便認為是circRNA。
Q8：CircRNA適宜用芯片技術還是測序技術？
建議使用測序技術，有利于新結果的發現和鑒定。
Q9：樣本間鑒定circRNA的差異大嗎？
大。樣本均一化操作在circRNA中是錯誤的，因為circRNA不屬于上面所提到的“絕大部分基因”（這部分基因在均一化時我們認為幾乎沒有變化），因此它的含量存在較大變化。
