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長鏈非編碼 RNA 測(cè)序
LncRNA高通量測(cè)序，采用去核糖體鏈特異性建庫方法，對(duì)長鏈非編碼 RNA、mRNA 、環(huán)狀RNA等大RNA進(jìn)行測(cè)序研究，從而快速全面準(zhǔn)確地獲得與特定生物學(xué)過程（例如發(fā)育、疾病等）所有大RNA轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)信息，可應(yīng)用于細(xì)胞分化和發(fā)育的研究、調(diào)控機(jī)理的研究、疾病標(biāo)志物的尋找、疾病的分子診斷、基因藥物的研發(fā)等。
產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)
1. 超高的技術(shù)穩(wěn)定性
同一樣本重復(fù)建庫相關(guān)性Pearson值大于0.993；
2. 豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)
已完成萬例lncRNA項(xiàng)目，涉及人鼠及動(dòng)植物物種；
3. 精湛的技術(shù)工藝
可承接人、鼠、動(dòng)植物樣品，外泌體、FFPE等，樣品起始量低至10ng；
4. Dr.Tom多組學(xué)數(shù)據(jù)挖掘系統(tǒng)交付，分析無憂
一次測(cè)序即可獲得mRNA、lncRNA、circRNA及關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)分析結(jié)果；
10大數(shù)據(jù)庫注釋，多維度結(jié)果圖片展示，數(shù)據(jù)圖表循環(huán)挖掘；
ceRNA、蛋白、共表達(dá)、關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因互作網(wǎng)絡(luò)分析可視化；
系統(tǒng)隨時(shí)更新文獻(xiàn)信息，查基因得文獻(xiàn)，便于文章撰寫；
5. 嚴(yán)格的質(zhì)量管理
實(shí)驗(yàn)全程采用全方位質(zhì)控體系，應(yīng)用質(zhì)量管理體系金標(biāo)準(zhǔn)；
6. 貼心的售后支持
7*24小時(shí)全天候技術(shù)支持，快速響應(yīng)客戶需求。
產(chǎn)品應(yīng)用
1. 細(xì)胞分化和發(fā)育調(diào)控機(jī)理的研究
2. 疾病標(biāo)志物的尋找
3. 疾病的分子診斷
4. 基因藥物的研發(fā)
信息分析內(nèi)容
標(biāo)準(zhǔn)信息分析（circRNA僅限人、小鼠）
1、基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
① 去除接頭序列、低質(zhì)量序列得到reads信息
② 樣品相關(guān)性
③ 表達(dá)量分布
④ RNA分類
2、參考基因組比對(duì)
3、lncRNA、mRNA、circRNA鑒定
4、lncRNA、mRNA、circRNA定量分析
5、lncRNA、mRNA差異表達(dá)分析（樣本間、組間）
6、lncRNA、mRNA表達(dá)/差異基因聚類
7、mRNA差異基因GO分類、富集
8、mRNA差異基因KEGG分類、富集
9、mRNA結(jié)構(gòu)分析
① 可變剪切分析
② 融合基因分析（僅限人）
10、可選：如需circRNA差異表達(dá)分析與表達(dá)/差異基因聚類分析，可基于交付數(shù)據(jù)自行在Dr. Tom系統(tǒng)上操作
高級(jí)信息分析
（一）數(shù)據(jù)庫注釋
1、轉(zhuǎn)錄因子注釋（AnimalTFDB/PlantTFDB）
2、GSEA分析
3、Rfam、Pfam、Reactome、COG、EggNOG和InterPro數(shù)據(jù)庫注釋
（二）互作網(wǎng)絡(luò)分析
1、靶基因分析
① miRNA-mRNA靶向關(guān)系分析
② lncRNA-mRNA靶向關(guān)系分析
2、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析
3、共表達(dá)互作網(wǎng)絡(luò)分析
（三）特色分析
1、外部數(shù)據(jù)庫關(guān)聯(lián)分析（TCGA、ARCHS4）
2、關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因網(wǎng)絡(luò)圖分析
3、時(shí)間序列分析
案例一、植物鹽脅迫相關(guān)lncRNA——鹽脅迫lncRNA的鑒定與功能研究 [1]
文章題目：The long noncoding RNA LAL contributes to salinity tolerance by modulating LHCB1s' expression in Medicago truncatula
發(fā)表期刊：Communications Biology
發(fā)表時(shí)間：2024年
研究摘要：
長鏈非編碼RNA（lncRNA）在植物中非常豐富，然而它們?cè)诖蠖鄶?shù)生物學(xué)過程中的調(diào)控作用仍然不清楚，例如在對(duì)植物生產(chǎn)有害的鹽脅迫響應(yīng)中。在這里，我們展示了在鹽處理的蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中鑒定的一個(gè) lncRNA 對(duì)耐鹽性很重要。我們將這個(gè) lncRNA 命名為 LAL，即對(duì)蒺藜苜蓿光合作用葉綠素a/b結(jié)合蛋白（MtLHCB）基因的反義長鏈非編碼 RNA。LAL 是位于染色體 6 上的四個(gè)連續(xù)MtLHCB 基因的反義鏈。在鹽處理的蒺藜苜蓿中，LAL 在早期被抑制，但后來被誘導(dǎo)；這一模式與四個(gè) MtLHCBs 相反。lal 突變體顯示出增強(qiáng)的耐鹽性，而在 lal 背景下過表達(dá) LAL 會(huì)破壞這種優(yōu)越的耐鹽性，這表明其在鹽脅迫響應(yīng)中的調(diào)控作用。通過在煙草葉片中瞬時(shí)共表達(dá) LAL 和 MtLHCB1.4-GFP，進(jìn)一步驗(yàn)證了 LAL 對(duì) MtLHCB1.4 的調(diào)控作用，在這一過程中鑒定了 MtLHCB1.4 的切割和干擾 RNA 的產(chǎn)生。這項(xiàng)工作展示了一個(gè) lncRNA LAL，通過調(diào)節(jié) MtLHCB1s 的表達(dá)，在蒺藜苜蓿中微調(diào)耐鹽性的作用。
結(jié)果展示：
圖1 長非編碼 RNA-LAL 在鹽脅迫、ABA（生長素）和 H2O2（過氧化氫）處理下的表達(dá)情況
案例二、腫瘤中的 lncRNA機(jī)制——長鏈非編碼RNA 衍生的肽段具有免疫原性 [2]
文章題目：Long non-coding RNA-derived peptides are immunogenic and drive a potent anti-tumour response
發(fā)表期刊：Nature Communications
發(fā)表時(shí)間：2023年
研究摘要：
蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 5（PRMT5）在多種癌癥中過度表達(dá)，其中主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 E2F1 是一個(gè)重要的甲基化靶標(biāo)。本研究探索了 PRMT5 和 E2F1 在調(diào)節(jié)非編碼基因組中的作用，并報(bào)道了對(duì)長鏈非編碼（lnc）RNA 基因表達(dá)的顯著影響。此外，許多與 MHC 類 I 蛋白相關(guān)的肽段來源于 lncRNA 基因中的小開放閱讀框。藥理學(xué)抑制 PRMT5 或調(diào)節(jié) E2F1 水平可以定性改變腫瘤細(xì)胞展示的 lncRNA 衍生肽段抗原。當(dāng)以體外負(fù)載的樹突狀細(xì)胞或從病毒載體中表達(dá)的方式呈現(xiàn)給免疫系統(tǒng)時(shí)，lncRNA 衍生的肽段可以驅(qū)動(dòng) CD8 T 淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗原特異性反應(yīng)，這導(dǎo)致腫瘤生長的顯著抑制。因此，lncRNA 基因編碼的免疫原性肽段可以作為癌癥疫苗使用。
主要研究結(jié)果：
圖2 HCT116細(xì)胞中l(wèi)ncRNA轉(zhuǎn)錄本的差異表達(dá)分析。
參考文獻(xiàn)：
[1] Zhao Y, Liu Y, Zhang F,et al. The long noncoding RNA LAL contributes to salinity tolerance by modulating LHCB1s' expression in Medicago truncatula. Commun Biol. 2024 Mar 8;7(1):289.
[2] Barczak W, Carr SM, Liu G, et al.Long non-coding RNA-derived peptides are immunogenic and drive a potent anti-tumour response. Nat Commun. 2023 Feb 25;14(1):1078.
圖1? lncRNA差異靶基因的聚類熱圖和KEGG功能富集圖
圖2? ?差異表達(dá)lncRNA與靶基因的蛋白互作和共表達(dá)互作網(wǎng)絡(luò)圖
鼠標(biāo)指連接線，可以立即展示相關(guān)文獻(xiàn)信息
表1 lncRNA組織樣品送樣建議
組織類型 | 具體要求 |
新鮮培養(yǎng)細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)） | ≥2×105 cells |
新鮮動(dòng)物組織干重 | ≥25 mg |
新鮮植物組織干重 | 嫩葉、嫩莖≥100 mg， 根、果實(shí)、種子、花等 |
全血（哺乳動(dòng)物） | ≥1 mL 全血分離的白細(xì)胞或 ≥1 mL PAXgene? Blood RNA Tube收集的全血 |
全血（非哺乳動(dòng)物） | ≥0.1 mL 全血分離的白 |
FFPE | ≥5片，未染色，100 mm2，5-10 μm厚度 |
表2 lncRNA測(cè)序樣品判定標(biāo)準(zhǔn)
|
樣本類型 |
總量 |
濃度 |
RIN |
28S/18S |
|
Total RNA |
≥200 ng |
20-500 ng/μL |
RIN≥6.0 |
28S/18S≥1.0 |
|
(human/mouse/rat) |
||||
|
Total RNA
(Cell： |
≥200 ng |
20-500 ng/μL |
RIN≥7.0 |
28S/18S≥1.0 |
|
human/mouse/rat) |
||||
|
Total RNA (Plant) |
≥1
μg |
40 -1000 ng/μL |
RIN≥6.0 |
28S/18S≥1.0 |
|
Total RNA |
≥1 μg |
40 -1000 ng/μL |
RIN≥6.0 |
28S/18S≥1.0 |
|
(Animal) |
||||
|
Total RNA
(Insect) |
≥1 μg |
40 -1000 ng/μL |
RIN≥6.0 |
N/A |
|
FFPE RNA |
≥200 ng |
70-500 ng/μL |
RIN≥2.0 |
DV200≥45% |
*備注：
（1）基線和5S：基線平整，5S 峰正常
（2）純度：無 DNA，蛋白/ 鹽離子等污染， 樣本無色透明 不粘稠，細(xì)胞樣本無 16S 和 23S 峰。
Q1：什么是長鏈非編碼RNA？以及它們的作用？
哺乳動(dòng)物基因組序列的約5%～10%被穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)編碼基因僅約占1%，其余4%～9%的序列都轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA。而非編碼RNA(non-coding RNA) 是指不能翻譯為蛋白的功能性RNA分子。長鏈非編碼RNA為這4%～9%中長度大于200nt的非編碼RNA。它們的作用主要體現(xiàn)在四個(gè)方面：第一，影響周邊基因的表達(dá)；第二，調(diào)控蛋白質(zhì)活動(dòng)及定位；第三，產(chǎn)生小分子RNA；第四，對(duì)其他RNA的調(diào)控作用[1]。
Q2：長鏈非編碼RNA的建庫方案是什么？
長鏈非編碼RNA建庫主要采用去除rRNA，構(gòu)建鏈特異性文庫，目前建庫比較穩(wěn)定。適用于人、鼠、動(dòng)植物等物種。
Q3：長鏈非編碼RNA主要簽約風(fēng)險(xiǎn)有哪些？
rRNA去除效率不穩(wěn)定，rRNA比例可能較高；只去除rRNA較適用于有良好參考基因組的項(xiàng)目，后續(xù)可以通過比對(duì)區(qū)分編碼和非編碼序列。
Q4：在信息分析中主要運(yùn)用到的軟件有哪些？
Tophat和Cufflinks（構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本），Infernal（家族分類），CPC（對(duì)轉(zhuǎn)錄本編碼能力進(jìn)行預(yù)測(cè)），Blast（比對(duì)），SOAP（過濾實(shí)驗(yàn)中未去除干凈的rRNA，及l(fā)ncRNA表達(dá)定量比對(duì)）。
Q5：長鏈非編碼RNA建庫測(cè)序結(jié)果可以用于分析環(huán)狀RNA嗎？
可以，長鏈非編碼RNA建庫模式采用去核糖體方式建庫，對(duì)所獲得的RNA進(jìn)行打斷測(cè)序，相當(dāng)于獲得全部RNA，即可以進(jìn)行分析環(huán)狀RNA表達(dá)情況，可應(yīng)用于分析各物種環(huán)狀RNA表達(dá)譜。
Q6：LncRNA測(cè)序數(shù)據(jù)中mRNA的定量效果如何？
人標(biāo)品：已知mRNA定量與qPCR定量斯皮爾曼系數(shù)達(dá)到0.88。
