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蛋白鑒定分析
蛋白鑒定分析，利用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)細(xì)胞、組織、體液或經(jīng)過分離、純化、富集后的蛋白膠/液等類型樣本中全部或特定的蛋白進(jìn)行種類鑒定，充分了解特定環(huán)境下蛋白質(zhì)種類情況是進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)，為研究疾病發(fā)生發(fā)展過程以及動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)提供直觀的蛋白質(zhì)種類鑒定結(jié)果。蛋白質(zhì)鑒定分析類產(chǎn)品按研究對(duì)象和內(nèi)容的不同，可分為以下兩個(gè)產(chǎn)品：蛋白全譜分析和膠條鑒定。
蛋白全譜分析
蛋白全譜分析是對(duì)蛋白質(zhì)組的整體分析方法，通過質(zhì)譜手段能得到盡可能多的蛋白質(zhì)信息。主要用于對(duì)未知樣品中含有的蛋白質(zhì)種類進(jìn)行全面的分析。基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白全譜分析，可以為蛋白質(zhì)高通量的定量和修飾分析提供參考信息。此外，結(jié)合全譜分析數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，可以相互補(bǔ)充并共同驗(yàn)證基因注釋及功能信息。
膠條/蛋白液分析
SDS-PAGE膠中分離出的指定條帶或較少組分（一百以內(nèi)）蛋白液進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。
圖1 膠條圖
產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)
- 儀器精準(zhǔn)：基于高分辨率（大于105）、高質(zhì)量精度（小于1ppm）質(zhì)譜平臺(tái)，確保鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性。
- 高鑒定性：系統(tǒng)全面地研究組織或細(xì)胞中盡可能多的蛋白質(zhì)，可鑒定多達(dá)6000種蛋白。
- 適用范圍廣：無物種特異性限制，理論上可用于所有物種。
產(chǎn)品應(yīng)用
- 疾病發(fā)生發(fā)展過程中的蛋白表達(dá)調(diào)控機(jī)制
- 動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制研究
- 抗逆抗病機(jī)制研究
技術(shù)路線
圖1 蛋白全譜、膠條鑒定的技術(shù)路線
信息分析內(nèi)容
信息分析條款 | 信息分析內(nèi)容 |
標(biāo)準(zhǔn)信息分析 | 1.1 數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì) 1.2 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果 1.3 蛋白質(zhì)GO分析 1.4 蛋白質(zhì)CCOG/KOG分析 1.5 蛋白質(zhì)Pathway代謝通路分析 |
個(gè)性化信息分析 | 2.1 單個(gè)樣本蛋白質(zhì)相對(duì)豐度定量（iBAQ） |
定制化信息分析 | 3.1 可結(jié)合客戶需求，協(xié)商確定定制化信息分析服務(wù)內(nèi)容。 |
1、基于質(zhì)譜技術(shù)對(duì)人腦組織中血腦屏障相關(guān)蛋白進(jìn)行鑒定
Identification of Blood?Brain Barrier-Associated Proteins in the Human Brain. J. Proteome Res. 2020
背景：
血腦屏障（BBB）對(duì)大腦穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，它控制著分子進(jìn)出大腦的選擇性通道。盡管血腦屏障在各種腦部疾病中起著至關(guān)重要的作用，并且與藥物的開發(fā)有關(guān)，但對(duì)其分子結(jié)構(gòu)知之甚少。特別是星形細(xì)胞端足與內(nèi)皮細(xì)胞之間基底層的組成目前還不完全清楚。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
7例未患腦部疾病尸檢病例的FFPE額葉皮質(zhì)組織塊，分別采集腦內(nèi)微血管、蛛網(wǎng)膜下腔蛛網(wǎng)膜血管和血管周圍腦組織三種類型的樣本，共計(jì)21例樣品，進(jìn)行LC-MS/MS蛋白全譜鑒定。
主要結(jié)果：
通過顯微解剖對(duì)樣品進(jìn)行純化，之后使用鳥槍蛋白質(zhì)組學(xué)提供了血腦屏障中鑒定到的蛋白質(zhì)列表。隨后的免疫組化詳細(xì)描述了這些蛋白各自的表達(dá)位點(diǎn)。證實(shí)膜蛋白MLC1和磷酸葡萄糖酶相關(guān)蛋白5（PGM5）在血腦屏障中特異性存在。鑒定出的蛋白在血腦屏障功能中的作用有待進(jìn)一步研究。
圖1 BBB相關(guān)蛋白研究流程
2、ABCA4對(duì)創(chuàng)傷性增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變影響的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
Proteomic evidence that ABCA4 is vital for traumatic proliferative vitreoretinopathy formation and development. Experimental Eye Research, 2019.
背景：
增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變（PVR）是視網(wǎng)膜脫離衰竭的主要原因。PVR發(fā)展的機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明，至今仍沒有有效的早期預(yù)防及臨床治療的方法。在整個(gè)PVR疾病過程中，視網(wǎng)膜蛋白呈現(xiàn)異常表達(dá)，但由于研究方法和技術(shù)的局限性，現(xiàn)在對(duì)PVR中視網(wǎng)膜蛋白的變化仍未完全解析。本課題通過SDS-PAGE與質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)，系統(tǒng)地分析和鑒定了PVR和非PVR（正常）眼的視網(wǎng)膜之間的差異蛋白質(zhì)表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)思路：
- 從9名患有創(chuàng)傷性PVR視網(wǎng)膜脫離的患者中收集的視網(wǎng)膜樣本
- 通過LC-MS/MS對(duì)樣品進(jìn)行分析得到總蛋白鑒定結(jié)果
技術(shù)路線：
提取總蛋白——SDS-PAGE——切取膠條——質(zhì)譜檢測(cè)——MaxQuant蛋白組學(xué)信息分析——后續(xù)驗(yàn)證
主要結(jié)果：
1）共鑒定到3,518種蛋白，差異表達(dá)蛋白數(shù)量為247。
2）ABCA4是PVR中差異表達(dá)最多的蛋白質(zhì)之一，與對(duì)照組（眼睛健康的患者組）相比，ABCA4在PVR標(biāo)本中顯著上調(diào)。
3）ABCA4下調(diào)導(dǎo)致RPE細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，從而抑制RPE細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)RPE細(xì)胞的凋亡。
圖2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中，ABCA4表達(dá)情況
A. 通過qRT-PCR測(cè)定ABCA4 mRNA表達(dá)；B. 通過蛋白質(zhì)印跡測(cè)定ABCA4蛋白質(zhì)水平
1. 標(biāo)準(zhǔn)信息分析
1.1 蛋白鑒定結(jié)果
蛋白鑒定結(jié)果表包含每個(gè)樣品鑒定到的蛋白具體信息，包括蛋白分組號(hào)、蛋白ID號(hào)、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、描述信息、鑒定覆蓋率、鑒定肽段數(shù)、鑒定譜圖數(shù)以及匹配相同肽段的蛋白質(zhì)ID。
表1 鑒定蛋白列表
Sample | Total_spectra | Identified_spectra | Identified_peptides | Identified_proteins |
Jurkat | 88053 | 43657 | 16708 | 5129 |
1.2 蛋白功能注釋分析
對(duì)鑒定到的蛋白，華大提供GO功能注釋分析，COG/KOG注釋分析和KEGG Pathway注釋分析等分析內(nèi)容。
圖1 GO功能注釋（左圖），COG注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)（右圖）
GO分類圖顯示了三個(gè)本體中所涉及到各條目的分布情況，不同顏色標(biāo)記為三個(gè)本體中涉及到的各個(gè)條目
1. 蛋白膠點(diǎn)膠條送樣要求
表1 蛋白膠條送樣要求
樣品類型/ 產(chǎn)品類型 | 膠條鑒定 |
考染、銀染膠點(diǎn)/膠條 | ≥1μg蛋白 |
單個(gè)蛋白（針對(duì)IP、Co-IP純化獲得的蛋白液） | ≥5μg，濃度≥0.5μg/μL |
注：銀染膠不能含用戊二醛；盡量送考染樣品，銀染可能存在假陽性；且保證在電泳后一周內(nèi)進(jìn)行切膠送樣
2. 蛋白全譜送樣要求
表2 蛋白全譜送樣要求
| 樣品類型 | 送樣量 | 備注 |
| 新鮮動(dòng)物組織干重 | ≥10mg | |
| 植物和蕈類真菌（如蘑菇、木耳）類樣品量濕重 | ≥500mg | 植物的種子和果實(shí)分別含淀粉和糖分較高，為避免提取的蛋白總量不達(dá)標(biāo)需再次送樣浪費(fèi)周期，送樣時(shí)盡量送2g以上。 |
| 酵母、霉菌類真菌和細(xì)菌、噬菌體等微生物 | ≥50mg，或細(xì)胞數(shù)≥5×106 | |
| 新鮮培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)(個(gè)) | ≥1×107 | |
| 客戶分離好的外泌體 | ≥100μg，濃度≥0.5μg/μL | |
| 血液類（去高豐度） | 血清、血漿≥200μl | 解凍后血細(xì)胞會(huì)破裂，蛋白溶出來會(huì)影響分析，因此一般不建議送全血。 |
表3 蛋白類樣品送樣要求
| 樣本類型 | 送樣量 |
| 蛋白液 | ≥200μg，濃度≥0.5μg/μL |
Q1：蛋白全譜分析鑒定數(shù)能達(dá)到多少？
A1：蛋白全譜分析鑒定到的蛋白數(shù)，與物種、樣本中蛋白質(zhì)含量及復(fù)雜程度、實(shí)驗(yàn)中蛋白組分分離程度、數(shù)據(jù)庫的完整度都有很大的關(guān)系。如植物來源的樣本中蛋白質(zhì)種類通常比動(dòng)物來源的樣本多，動(dòng)物組織樣本中蛋白質(zhì)種類通常比其血液樣本多。一般情況下，一次全譜分析可以鑒定到7000個(gè)左右的蛋白種類。
?
Q2：雙向凝膠電泳與質(zhì)譜聯(lián)用鑒定蛋白質(zhì)的過程是什么？
A2：通過對(duì)蛋白質(zhì)雙向電泳的圖譜掃描，進(jìn)行譜圖差異分析，找到差異點(diǎn)。把差異點(diǎn)切出，進(jìn)行脫色、酶解、質(zhì)譜檢測(cè)，得到質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)文件，通過數(shù)據(jù)庫搜索可以得到差異點(diǎn)中的蛋白質(zhì)的詳細(xì)信息。
?
Q3：華大可以對(duì)Co-IP獲得的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定嗎？
?A3：可以，這屬于我們的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品“非膠條鑒定”，建議直接將IP后洗脫下來的蛋白液送樣，無需跑膠切膠，如果洗脫后蛋白液體積較大，蛋白濃度較低，建議濃縮后送樣。
?Q4：Co-IP后蛋白液添加了loading?buffer并經(jīng)煮沸處理，可以鑒定嗎？
?A4：可以，在送樣登記表中注明此情況并添加loading?buffer成分即可。
