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TMT蛋白定量分析
定量蛋白質組學（Quantitative Proteomics）是對一個基因組表達的全部蛋白質或一個復雜混合體系內所有蛋白質進行精確鑒定和定量。可用于篩選和尋找任何因素引起的樣本之間的差異表達蛋白，結合生物信息學揭示細胞生理病理功能，同時也可對某些關鍵蛋白進行定性和定量分析。
TMT（Tandem Mass Tag）串聯質譜標記技術是由Thermo公司研發的一種體外同重同位素標記的相對與絕對定量技術。蛋白定量TMT技術利用多種同位素試劑標記蛋白多肽N末端或賴氨酸側鏈基團，包括4plex、8plex、16plex等不同數量標簽的產品，經高精度質譜儀串聯分析，最新推出的TMTpro 18plex可同時比較多達18個樣品之間的蛋白組表達量差異，是近年來定量蛋白質組學常用的高通量篩選技術。
圖1 TMT試劑結構
產品優勢
- 通量高：可同時對2-18種以內實驗樣本進行蛋白組定量分析和比較；
- 周期短：標記混合上樣大幅度壓縮機時，縮短項目周期；
- 重復性高：采用多個標記樣本同時上機的方法，避免樣本分別上機檢測和傳統制膠實驗重復性差的問題；
- 經驗豐富：10余年豐富項目經驗，40+項質控保障，200+篇質譜文章發表；
- 云平臺交付：采用Dr. Tom云平臺進行數據交付，便于開展零生信基礎的數據挖掘，以及同轉錄組的自主關聯分析；
- 一站式、多組學服務：提供經典的蛋白質組非靶向發現+靶向驗證一站式服務；以及蛋白質組+轉錄組、蛋白質組+代謝組、常規蛋白質組+磷酸化蛋白質組學等一系列多組學關聯分析服務。
產品應用
- 人類疾病研究：
疾病生物標志物篩選和驗證
疾病發生發展過程中的蛋白表達調控機制
藥效評估
- 動植物基礎研究：
重要農作物農藝性及其改良措施
動植物生長發育機制研究
抗逆抗病機制研究
- 微生物領域研究：
致病機理研究
耐藥性研究
宿主-微生物的相互作用機制研究
技術路線
信息分析
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信息分析條款 |
信息分析條款 |
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標準信息分析 |
1 標準信息分析內容 1.1 數據產出統計 1.2 蛋白質鑒定結果 1.3 蛋白質定量結果 1.4 蛋白質GO分析 1.5 蛋白質KOG/COG/eggNOG分析 1.6 蛋白質Pathway代謝通路分析 1.7 差異蛋白的GO富集分析 1.8 差異蛋白的Pathway富集分析 1.9 差異蛋白KOG/COG/eggNOG富集分析 1.10 重復性分析（僅針對設計了重復的實驗） 1.11多樣品間表達模式聚類（三個或三個以上樣品可提供） 1.12 差異表達蛋白互作分析 1.13 差異表達蛋白亞細胞定位 1.14 蛋白信號調控分析（針對人和小鼠） 配體-受體調控分析，激酶-底物調控分析，轉錄因子-靶蛋白調控，蛋白信號調控分析 |
1、TMT蛋白定量+RNA-Seq多組學利器研究腎臟衰老的分子機制
Proteomics?and?transcriptomic?profiling?reveal?different?aspects?of?aging?in?the?kidney.?eLife.?2021
背景：
衰老的特點是所有器官生理功能下降、發病率和死亡率增加。而腎功能在衰老的早期就會受到影響，并隨年齡的增長逐漸下降；通過血液和尿液測量腎臟的功能變化相對容易和無創；此外腎臟功能能顯著影響其他器官的衰老相關疾病，如認知障礙。因此腎臟是研究器官特異性衰老的一個極好的模型。雖然腎功能的生理變化已經得到了很好的闡述，但人們對驅動年齡相關功能喪失的潛在分子機制仍知之甚少。?
方案設計：
188只多樣性遠系繁殖（DO）小鼠的右腎組織，包括6個月大的30只雄性和33只雌性小鼠、12個月大的31只雄性和31只雌性小鼠、18個月大的34只雄性和29只雌性小鼠。?
主要結果：
1）mRNA和蛋白質隨年齡產生的變化與免疫浸潤增加和線粒體功能下降有關；
2）與mRNA相比，蛋白質表現出更大程度的變化，并揭示了一系列廣泛的生物過程的變化，包括腎臟老化的獨特的、器官特異性的特征；
3）研究還發現在mRNA沒有相應變化的情況下，蛋白質中與年齡相關的功能產生了變化。表明mRNA只能提供腎臟分子老化的不完整數據，同時檢測蛋白質的變化對于理解不受轉錄調控的老化過程至關重要。
圖1?年齡相關的蛋白質表達量變化并不是由mRNA表達所介導的
2、iTRAQ+MRM揭示蝴蝶蘭春化作用分子機制
Proteomic?Analysis?of?the?Early?Development?of?the?Phalaenopsis?amabilis?Flower?Bud?under?Low?Temperature?Induction?Using?the?iTRAQ/MRM?Approach.?Molecules.?2020.
背景：
蝴蝶蘭（Phalaenopsis?amabilis）是一種經過春化、需要低溫處理才能開花的蘭花，造型優美，花色艷麗，是國際花卉市場上最重要的植物之一。然而當前關于蝴蝶蘭的花發育相關的蛋白質組學研究報道較少。
實驗設計：
利用iTRAQ對常溫和低溫處理0、10和20天的蝴蝶蘭花芽進行蛋白質組學分析，對屬于春化作用途徑的差異表達蛋白利用靶向蛋白質組學MRM技術驗證。?
主要結果：
1）利用iTRAQ對常溫和低溫處理下的蝴蝶蘭進行蛋白質組學分析，共鑒定到了5,064個蛋白，其中42個差異蛋白屬于光周期、春化途徑、激素途徑、碳代謝、能量代謝和應激反應相關；
2）對與春化途徑相關的蛋白質中，PEQU_11434和PEQU_19304上調，且通過MRM技術得到驗證。推測O-GlcNAc糖基化參與VRN1的轉錄后修飾，GRP2蛋白（富含甘氨酸的RNA結合蛋白）糖基化減輕其與VRN1前體mRNA的結合，促進VRN1的表達和開花。
圖2?差異蛋白KEGG?Pathway富集分析
1、蛋白鑒定結果
表1 蛋白鑒定情況
2、蛋白定量結果
TMT定量由華大開發軟件IQuant來實現。單次實驗的顯著差異蛋白以Fold change ≥ 1.2 和Q-value < 0.05 兩個條件篩選。
3、差異蛋白分析
差異蛋白聚類分析和多種功能注釋富集分析。
4、差異蛋白互作分析和亞細胞定位
蛋白之間通常通過相互作用結合成復合物之后行使相應的功能，華大提供對差異表達蛋白的互作分析。蛋白質在核糖體中合成后經蛋白質分選信號引導后被轉運到特定的細胞器中，部分蛋白質則被分泌到細胞外或留在細胞質中，只有轉運到正確的部位才能參與細胞的各種生命活動。蛋白質的亞細胞定位是蛋白功能注釋的重要部分。
1、組織類樣品送樣要求
表1 組織類樣品送樣要求
| 樣品類型 | 送樣量 | 備注 |
| 新鮮動物組織干重 | ≥10mg | 富含雜質或蛋白質含量低的樣品量干重≥5g，如植物的根、木質部、韌皮部組織等 |
植物和蕈類真菌（如蘑菇、木耳）類 樣品量濕重 | ≥300mg | |
| 酵母、霉菌類真菌和細菌、噬菌體等微生物 | ≥50mg，或細胞數≥5×106 | |
| 新鮮培養細胞數(個) | ≥5×106（細胞沉淀體積約30μl~50μl左右） | |
| 客戶分離好的外泌體 | ≥300μL，約1011 濃Particles/mL | |
| 血液類（去高豐度） | 血清、血漿≥200μl | 解凍后血細胞會破裂，蛋白溶出來會影響分析，因此一般不建議送全血 |
2、蛋白類樣品送樣要求
表2 蛋白類樣品送樣要求
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樣本類型 |
送樣量 |
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蛋白液 |
≥100μg，濃度≥0.5μg/μL |
Q1：TMT等標記定量怎樣設置重復？
A2：推薦至少進行3次或以上生物學重復，否則實驗結果一般不能被雜志接收。
Q2：不同試驗的樣本做TMT等標記定量可否放在一組上機？
A3：不能。因為不同試驗的研究對象一般有差異，即便是同樣的物種，處理方式也會有不同，這種情況下，不同來源的樣本混在一起上機，會大大提高樣本中蛋白種類的復雜程度，影響質譜的分辨能力，降低蛋白鑒定數目和定量效果。所以不同來源的樣本，蛋白表達差異過大者，必須分別上機進行檢測。
Q3：為什么有些差異表達基因在蛋白層面沒有相應的差異蛋白？
A4：從生物學角度看，由于RNA調控、蛋白降解、蛋白分泌、轉錄和翻譯效率不一致等原因，導致蛋白水平和轉錄水平未必呈現一樣的趨勢，這是正常現象。
Q4：只通過TMT等蛋白標記定量技術找到的差異蛋白，可否直接認定為biomarkers？
A5：從生物實驗的角度來講，通過一種實驗得到的結果是需要再進行驗證的。在發現階段，用TMT等標記定量技術找到的差異蛋白，一般還需要通過其他技術進行驗證后，再得出最終的結論，推薦采用目標蛋白定量MRM/PRM技術，或者傳統的western blotting（Western Blot）技術進行驗證。
