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PRM目標蛋白定量分析
PRM作為靶向蛋白質組研究策略，可以有目標地檢測分析特定的關鍵蛋白質在多樣本中的含量變化情況的高通量檢測技術產品。PRM技術借助Q-Orbitrap為代表的四極桿-高分辨質譜平臺進行數據采集，在四級桿（Q1）選出的目標肽段離子，進入碰撞室中打碎，所有的碎片離子經過質量分析器產生一張高分辨的二級質譜圖，通過提取其中的碎片離子信息即可實現目標肽段的定量。
圖1 目標蛋白MRM/PRM技術原理介紹
產品優(yōu)勢
- 通量高：一次上機檢測，可同時得到幾十甚至上百種目標蛋白的定量信息
- 周期短：無需抗體制備和Western Blotting實驗過程，極大縮短了項目周期
- 準確性高：通過對目標蛋白母子離子對或母離子的選擇，去除干擾離子，靶向精確定量
- 特異性高：避免抗體制備過程中引入的非特異性結合因素，高效篩選目標蛋白。
產品應用
- 大范圍蛋白質組檢測后的目標蛋白驗證
- 同源蛋白或突變蛋白定量研究
- 開發(fā)臨床診斷預測試劑盒
技術路線
圖2 技術流程圖
1、使用 Orbitrap 系列質譜儀進行 DDA（數據依賴性采集）模式采集數據，篩選出可檢測的目標肽段 PRM list；
2、對靶標肽段離子進行 PRM 模式檢測，獲得子離子的信號；
3、通過分析軟件（如 Skyline）進行特征子離子的篩選和峰面積積分，得到高分辨、高特異性的蛋白相對定量值。
信息分析流程
1、方法建立
1）目標蛋白總結；
2）數據質控；
3）PRM方法展示。
2、樣本檢測
1）定量信息；
2）數據歸一化；
3）目標蛋白相對定量。
3、定制化信息分析
可結合客戶的需求，協商確定定制化信息分析內容。
1、DIA+PRM鑒定新冠重癥生物標志物（華大合作案例）
Multi-platform?omics?analysis?reveals?molecular?signature?for?COVID-19?pathogenesis,?prognosis?and?drug?target?discovery.?Signal?Transduction?and?Targeted?Therapy.?2021
背景：
新冠肺炎肆虐已久，截止2021年8月，全球累計確診超2.8億例，其最常見的臨床癥狀是肺炎伴發(fā)熱、咳嗽和呼吸困難。根據《中國政府診療指南(試行第七版)》，COVID19患者根據其不同的臨床表現分為四個亞組：輕癥、普通、重癥和危重癥。重癥患者的死亡率遠高于非重癥患者，但目前仍沒有針對重癥患者治療的相關藥物獲批，標準治療往往是支持措施如引入呼吸機等。因此，尋找能夠從分子層面預測患者疾病嚴重程度的生物標志物，將有助于指定更有針對性的診療和支持措施，提高新冠患者的生存率和預后效果。
實驗設計：
對發(fā)現隊列10名重癥患者、10名非重癥患者和10名健康志愿者共計30例血漿樣品，進行DIA蛋白定量、脂質組和氨基酸檢測，建立隨機森林機器學習模型，對篩選到的用于預測新冠嚴重程度的生物標志物利用MRM/PRM在兩個驗證隊列中進行驗證。
圖1?研究樣品及多組學流程
主要結果：
1)?對發(fā)現隊列共計30例血漿樣品，進行DIA蛋白定量、脂質組和氨基酸檢測，分別定量到1,254個蛋白質、664個脂質小分子和16種氨基酸，并與公共數據集互補。發(fā)現了獨特的蛋白質特征，例如TETN和CAMP，它們可用作COVID-19的新潛在藥物靶標或生物標志物。
2)?對發(fā)現隊列的蛋白質組、脂質組和氨基酸檢測數據，建立隨機森林機器學習模型，初步篩選到21個脂質和4個蛋白質，共計25個物質組成的panel可作為潛在的預測疾病嚴重程度的生物標志物；并進一步采用MRM或PRM在兩個驗證隊列中進行了驗證。
2、青稞β-葡聚糖合成和積累分子機制研究
Quantitative?Proteome?Profiling?Provides?Insight?into?the?Proteins?Associated?with?β-Glucan?Accumulation?in?Hull-less?Barley?Grains.?J?Agric?Food?Chem.?2021
背景：
青稞是中國藏區(qū)廣泛種植的主要糧食作物，其籽粒中β-葡聚糖（BG）含量較高。但從蛋白質水平考察青稞BG合成和積累機制的究還很缺乏。
研究思路：
利用TMT定量蛋白質組學方法，對開花后20、30、40d的青稞種子蛋白質組進行比較。
主要結果：
1)?共鑒定出4,283個蛋白質，其中759個在種子發(fā)育過程中差異表達；
2)?發(fā)現細胞壁修飾、碳和能量代謝、多糖代謝、轉錄后修飾和囊泡轉運是青稞?BG?積累相關的關鍵生物過程。淀粉合成酶、淀粉分支酶、果膠乙酰酯酶、β-?葡萄糖苷酶、β-淀粉酶、1,4-β-木聚糖等與BG的合成有關。參與糖酵解、糖異生和乙醛酸旁路途徑的蛋白質為BG的儲存提供能量和還原能力；
3)?PRM和qPCR證實了基于TMT獲得的蛋白質表達譜。
1、PRM數據歸一化
本項目利用外參蛋白Biognosys|iRT-Kit_WR_fusion的方法進行數據歸一化，以降低PRM非標定量的實驗誤差。一般情況下，所有transition的信號都會用于目標蛋白的定量，但是如果發(fā)現個別transition由于背景干擾導致強度跟其他transition不一致，則會去除這些transition。目標蛋白的每個transition的信號會通過Biognosys|iRT-Kit_WR_fusion的信號進行歸一化。
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圖2 數據歸一化過程
左圖為目標蛋白每個肽段的色譜出峰時間誤差，RT≤±2min；右圖為目標蛋白所有transition歸一化強度分布
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2、目標蛋白相對定量
在提取目標蛋白所有歸一化強度后，本項目利用一個線性混合模型進行目標蛋白在樣品中的相對定量，此模型整合在MSstats工具包中[3]，該統(tǒng)計分析會給出蛋白在比較組的比值以及校正p值（adjusted?p-value）。校正p值也反映原始統(tǒng)計檢驗的假陽性（Benjamini?and?Hochberg方法），目標蛋白在1.5倍差異且校正p值<0.05（假陽性<0.05）的條件下認為是差異蛋白。
圖3 目標蛋白相對定量
其中，左圖為目標蛋白所有肽段質定量信息變異系數分布，一般認為80%的肽段CV<20%為數據質量好；右圖為目標蛋白在所有比較組的相對定量分布，橫坐標為比值取log2，縱坐標為校正p值取-log10，目標蛋白在1.5倍差異且校正p值<0.05的條件下認為是差異蛋白。
1、組織類樣品送樣要求
表1 組織類樣品送樣要求
| 樣品類型 | 送樣量 | 備注 |
| 新鮮動物組織干重 | ≥10mg | 富含雜質或蛋白質含量低的樣品量干重≥5g，如植物的根、木質部、韌皮部組織等 |
| 植物、蕈類真菌（如蘑菇、木耳）類 樣品量濕重 |
≥300mg | |
| 酵母、霉菌類真菌和細菌、噬菌體等微生物 | ≥50mg，或細胞數≥5×106 | |
| 新鮮培養(yǎng)細胞數(個) | ≥1×107（細胞沉淀體積約30μl~50μl左右） | |
| 客戶分離好的外泌體 | ≥50μg，濃度≥0.5μg/μL | |
| 血液類（去高豐度） | 血清、血漿≥200μL | 解凍后血細胞會破裂，蛋白溶出來會影響分析，因此一般不建議送全血 |
2、蛋白類樣品送樣要求
表2 蛋白類樣品送樣要求
|
樣本類型 |
送樣量 |
|
蛋白液 |
≥100μg，濃度≥0.5μg/μL |
Q1：只知道蛋白序列，PRM技術能否像Western?blot技術一樣精確的找到該蛋白并對它的量進行分析？?
A1：有目標蛋白的序列信息，PRM是可以替代Western?lot技術進行目標蛋白的精確定量，定性和差異分析。?
Q2：?PRM技術進行質譜時，可以一次監(jiān)測多少個蛋白？是只能對一個特定蛋白監(jiān)測，還是多個特定蛋白同時監(jiān)測？?
A2：主要根據蛋白豐度和樣本基質的情況決定，不同樣本不同蛋白的理化性質不一樣，一般情況下，?PRM技術可以同時檢測幾十到上百個蛋白質。?
Q3：如果不知道蛋白質的信息，能否進行PRM？若只有基因組的信息，能否進行？?
A3：進行PRM必須明確知道目標蛋白質，并獲得蛋白質的全序列；如果有基因組信息，一般都會有預測編碼蛋白序列，可以先翻譯成氨基酸序列再進行PRM。?
