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蛋白磷酸化修飾分析
蛋白翻譯后修飾（Post-translational modification, PTM）指蛋白經生物合成后的共價修飾及酶學修飾，修飾作用可發生在蛋白氨基酸側鏈及其C或N末端，通過對現有20種氨基酸官能團的改造或者引入新的基團（如磷酸基、乙酰基等）來實現其功能的擴展，大多數真核生物所表達的蛋白質需經過一系列的翻譯后加工和修飾才能形成最終復雜的功能執行體，因此蛋白質的翻譯后修飾成為蛋白質組學研究的重要方面。
翻譯后修飾蛋白質在樣本中含量低且動態范圍廣，其相關研究極具挑戰性，親和富集、多維分離等技術與生物質譜的結合為翻譯后修飾蛋白質組學的發展提供了契機。目前，已進行規模化研究的蛋白修飾主要有磷酸化（Phosphorylation）、乙酰化（Acetylation）、糖基化（Glycosylation）、泛素化（Ubiquitination）等。
其中，蛋白質磷酸化（Phosphorylation）是最常見、最重要的一種蛋白翻譯后修飾方式，發生在蛋白質絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸上，它由兩個作用相反的酶系——蛋白激酶和磷酸酶進行調控。
蛋白磷酸化修飾分析技術，主要包括蛋白磷酸化鑒定（純化蛋白磷酸化鑒定/磷酸化蛋白全譜鑒定）和蛋白磷酸化定量。華大基因的蛋白磷酸化定量產品主要包括以下幾種。
產品名稱 | 產品優勢 |
蛋白磷酸化修飾TMT標記定量 | 一次性比較多個樣本，極大地降低了實驗誤差，提高定量準確性。 |
蛋白磷酸化修飾 DIA非標記定量 | 高深度：1h鑒定磷酸化肽段近15,000；高準確性：定量相關性達0.95；多維高精度：同常規蛋白定量強強聯合，探索蛋白表達“全景圖”。 |
（1）蛋白磷酸化修飾標記定量
蛋白磷酸化修飾標記定量是基于高精度、高靈敏度質譜儀，將TMT定量技術與富集技術相結合，對生物體的修飾蛋白進行鑒定并相對定量，從而達到研究生物體內修飾蛋白質組動態變化與集體表型改變之間關系的目的。
圖1 蛋白磷酸化修飾TMT定量技術路線
（2）蛋白磷酸化修飾DIA非標記定量
基于DIA全景掃描的無偏模式，DIA磷酸化蛋白質組得以突破傳統DDA的限制，能夠有效解決磷酸化修飾定性定量的難題，推進磷酸化分析向更高鑒定深度、更高定量重復性和定量準確性的方向發展。
圖2 蛋白磷酸化修飾DIA定量技術路線
信息分析內容
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信息分析條款 |
信息分析內容 |
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標準信息分析 |
1 項目概述及質控分析 1.1項目概述 1.2數據質控 1.3鑒定與定量細節表 2 磷酸化蛋白組鑒定 2.1磷酸化蛋白組鑒定結果統計 2.2磷酸化蛋白質組鑒定的質量評估 2.3磷酸化位點統計 3 磷酸化蛋白組定量 3.1差異定量分析 3.2主成分分析 3.3聚類分析 3.4時間序列分析 4 磷酸化蛋白組功能注釋 4.1磷酸化蛋白質GO注釋 4.2磷酸化蛋白質KOG注釋 4.3磷酸化蛋白質Pathway代謝通路注釋 5 差異磷酸化肽段對應蛋白的功能注釋 5.1 GO富集分析 5.2 Pathway富集分析 5.3 KOG注釋 5.4差異磷酸化肽段對應蛋白互作分析 5.5差異磷酸化肽段對應蛋白的亞細胞定位 6 磷酸化肽段Motif分析 |
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定制化信息分析 |
可結合客戶的需求，協商確定定制化信息分析服務內容。 |
1、基于數據非依賴型（DIA）質譜采集的方法的快速磷酸化蛋白質組學
Bekker-Jensen?D?B,?Bernhardt?O?M,?Hogrebe?A,?et?al.?Rapid?and?site-specific?deep?phosphoproteome?profiling?by?data-independent?acquisition?without?the?need?for?spectral?libraries[.?Nature?Communications,?2020.
背景：
磷酸化是最重要的翻譯后修飾之一，目前大多數磷酸化蛋白質組學研究需要通過質譜技術進行數天甚至數周的數據采集和分析，分析大量樣品中的磷酸化位點仍具有挑戰性。
實驗設計：
通過開發一種優化的DIA磷酸化蛋白質組學方法，系統地、可重復地分析數百個樣品中的磷酸化位點。同時運用此技術來確定表皮生長因子信號通路的主要蛋白激酶的磷酸化位點。
主要結果：
1）優化了分析流程，通過調整參數設置優化儀器設置從而獲得最佳DIA性能。與目前先進的基于數據依賴采集模式（DDA）的磷酸化蛋白組學相比，基于DIA的磷酸化蛋白組學具有更寬的動態范圍、更高的鑒定重復性、更高的定量靈敏度和準確性。
2）以視網膜色素上皮細胞（Retinal?pigment?epithelium,?RPE1）為實驗對象，使用不同MEK激酶抑制劑（MEK?kinase?inhibitors）與RPE1細胞反應以誘導產生相應的信號通路。采用DDA和DIA方法采集的數據通仍然通過MQ軟件與SQ軟件進行分析，DIA的整體結果均優于DDA結果。
圖1 DDA和DIA磷酸化蛋白質組學鑒定和定量
2、草魚柔軟和堅硬肌肉的磷酸化蛋白組學分析
Quantitative phosphoproteomic analysis of soft and firm grass carp muscle. Food Chemistry, 2020
背景：魚的肌肉硬度是消費者接受的一個重要質量特征，也是魚產品生產者、加工商和消費者重要的質量指標之一，更好的質地使魚易于加工成高質量的產品。磷酸化蛋白組學分析被證明是一種了解與肉質形成相關的生物過程的有效方法，如肉色穩定性、pH值下降和肌肉糖酵解，但這項技術很少應用于魚類。
實驗設計：
6個脆草魚和6個普通草魚的肌肉組織進行磷酸化iTRAQ。
主要結果：
在脆草魚中，鑒定到27個上調和22個下調的磷酸化肽段及其潛在的上游激酶。蛋白互作分析將這些磷酸化蛋白聚類為四組：12個骨骼肌纖維蛋白、1個結締組織蛋白、3個信號調節蛋白和4個碳水化合物代謝蛋白；肌球蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白、緊密連接途徑和糖酵解途徑可能有助于增強肌肉硬度。這些結果為蛋白質磷酸化在魚類肌肉硬度中的作用提供了新的見解，并將有助于提高魚產品的質量。
圖2?脆皮草魚和普通草魚肌肉中差異磷酸化蛋白的GO和pathway富集分析
a. GO富集分析； b. KEGG富集分析(Top30)
圖3?高度表示它們在各自位置出現的頻率，顏色代表了它們的理化性質
圖4?磷酸化蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖
紅色代表上調，綠色代表下調，藍色代表上調和下調同時存在
1、項目概述及質控分析
基于磷酸化蛋白質組定量分析結果，分別從磷酸化肽段、磷酸化位點和磷酸化蛋白三個層面統計整體項目及各樣本的鑒定情況。
之后分別從組內變異系數，主成分分析以及樣本定量相關性等方面評估數據的質量。當樣本數目較多時，會在連續上機樣本中間斷插入QC樣本，從而能在質控分析中評估實驗條件，以便確保實驗的穩定性和重復性。
圖1 CV分布（左）、主成分分析（中）和樣本相關性分析熱圖（右）
2、磷酸化肽段定量及差異磷酸化蛋白富集分析
在4D-DIA定量中，通常通過差異倍數大于1.5或小于2/3，同時滿足統計檢驗P-value值小于0.05篩選顯著差異表達磷酸化肽段，并繪制火山圖。對差異磷酸化肽段對應的蛋白質，分別進行GO、KOG和KEGG?pathway富集等多種功能注釋富集分析。
圖2 磷酸化肽段定量及差異磷酸化蛋白富集分析
左圖為磷酸化肽段定量分析火山圖，橫軸為肽段定量值（log2化），縱軸為統計檢驗的P-value（-log化）；分布在該火山圖左上、右上兩區域的肽段為顯著差異的肽段、中圖為差異磷酸化蛋白GO富集分析，右圖為差異磷酸化蛋白KEGG Pathway富集分析氣泡圖。
3、磷酸化位點motif分析和激酶-底物分析
Motif是比較有特征的短序列，會多次出現并被假設擁有生物學功能。而且，經常是一些具有序列特異性的蛋白結合位點（如轉錄因子）或者涉及到重要生物過程。
圖3 蛋白磷酸化位點Motif分析
人基因組注釋信息顯示人類有518個激酶，主要分為9個組：AGC（蛋白激酶A、G、C組）、Atypical（非典型組）、CAMK（鈣調節激酶組）、CK1（酪蛋白激酶組）、CMGC（蛋白激酶CDK、MAPK、GSK3、CLK組）、STE（酵母STE7、11、20同源基因激酶組）、TK（酪氨酸激酶組）、TKL（類酪氨酸激酶組）和其他，90個家族、145個亞族。不同家族偏向有不一樣的功能。
圖4 激酶-底物分析
樣品類型 | DIA磷酸化蛋白定量 | |
動物類 | 常見動物組織：動物內臟（心、肝、脾、肺、腎）、皮膚、肌肉、腦等 | ≥10mg |
軟體動物類（弓形蟲、血吸蟲、果蠅、螨蟲、小菜蛾、灰飛虱、絳蟲、蟬、渦鞭蟲等） | ≥10mg | |
細胞類 | 懸浮細胞、貼壁細胞 | ≥1×107 |
植物類 | 植物的嫩枝部（葉芽、嫩葉片）、藻類 | ≥1g |
植物的老葉、根、莖，樹皮 | ≥2g | |
植物的花蕾、花粉 | ≥100mg | |
植物的種子（水稻/小麥種子等）、果實（蘋果、水蜜桃、梨） | ≥1g | |
微生物類 | 原核細菌（大腸桿菌、沃氏葡萄球菌等），真菌（酵母等） 原核樣品不推薦做磷酸化修飾 | 菌體≥100mg 或細胞數≥1×107 |
蛋白液類 | 復雜樣品蛋白液、蛋白粉末 | ≥1mg 濃度≥0.5μg/μL |
Q1：磷酸化位點是如何確定的？
A1：一種特定的翻譯后修飾通常會作用于一定的氨基酸，經修飾后，這一類氨基酸會增加相同的分子量，如，磷酸化肽段因加入磷酸化基團而產生+80的質量偏移。基于質量偏移的理論，利用生物信息學方法可以分析質譜數據鑒定磷酸化翻譯后修飾。
Q2：磷酸化蛋白質組富集策略有哪些？如何選擇？
A2: 對于磷酸化蛋白的分離富集
1）抗體富集法：就是用識別磷酸化氨基酸殘基的特異抗體進行免疫共沉淀,從復雜混合物中免疫沉淀目標蛋白質，是較為簡單的方法；
2）激酶特異富集法：利用小分子的磷酸激酶抑制劑對其進行特異親和層析成為激酶磷酸化蛋白質組學研究的重要方法；
3）親和富集法：利用磷酸基團與一些金屬離子或金屬氧化物等的親和作用,實現對磷酸化蛋白的富集。
對于磷酸化肽段的分離富集
1）化學修飾富集法：用親和試劑取代磷酸化肽段上的磷酸集團, 再用親和提取的方法從混合肽段中分離磷酸化肽段, 是一種有效的化學修飾法；
2）色譜分離富集法：包括IMAC富集法、金屬氧化物（如TiO2等）和金屬氫氧化物富集方法、陰陽離子交換富集法以及親水性相互作用色譜法等；
3）MALDI靶盤富集法：為了滿足對磷酸化蛋白的高通量分析以及微量樣品的分析, 可以采用在線富集后直接質譜鑒定的方法。利用MALDI靶盤可實現直接在線富集檢測。
據文獻報道酪氨酸磷酸化比例最少，僅占整體磷酸化肽段的1%，如果實驗目的只關注酪氨酸磷酸化的變化時，建議選擇酪氨酸磷酸化抗體進行富集。如果實驗關注的是非酪氨酸，或者是所有可以發生磷酸化的氨基酸（絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸），由于抗絲、蘇氨酸磷酸化抗體抗原決定簇較小，使得抗原抗體的結合位點村長空間障礙，特異性較差，所以建議選擇IMAC或TiO2富集。
