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單管單細胞轉錄組測序
單細胞RNA測序技術概述
目前高通量測序技術已經深入到人類疾病、物種進化、動植物分子育種等傳統的生物學研究領域中，逐漸成為一種不可或缺的研究工具。然而隨著生命科學和醫學基礎研究的深入發展，人們發現越來越多的特殊標本和特定的生物學現象，如法醫鑒定的微量標本、腫瘤內部異質性等無法用常規組織測序的方法進行研究。單細胞測序技術的出現，給這類樣本的研究帶來了極大的便利。
單細胞測序技術經過了10余年的發展，取得了眾多的技術進展與突破。其中，單細胞RNA測序技術中，Smart-Seq方法以其可實現完整mRNA擴增的優勢，被廣泛的應用。而近期廣受關注的另外一個高通量單細胞RNA測序技術由Macosko E團隊開發，其研究成果于2015年發表在《Cell》雜志上，該技術結合了微流控液滴法，磁珠對細胞進行標記，可一次性完成多至一百萬個細胞分離和擴增建庫，這個技術的出現大幅的降低了單細胞RNA測序的成本，使得單細胞RNA水平的研究得到了飛躍發展。
華大基因依托于這兩個技術開發優化的相應單細胞RNA測序產品：單管單細胞RNA測序、高通量單細胞RNA-Seq 。其中，單管單細胞RNA測序，采用的是基于Smart-Seq2的擴增方法，獲得全長轉錄本，隨后Tn5轉座酶進行建庫測序，該擴增方法不僅可以用于轉錄本的定量，還可以分析結構變異和功能方面的信息。
研究流程
圖1 單細胞RNA測序技術流程圖
Smart-Seq擴增原理
單細胞RNA水平的研究的主要難點是單個細胞RNA含量只有pg級別，不易直接提取RNA后構建高通量文庫。華大基因的單管單細胞RNA測序產品利用Smart-Seq2方法，通過oligo dT 直接對mRNA進行反轉錄，在逆轉錄的過程中，利用一個叫MMLVRT（Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase，MMLVRT)的逆轉錄酶，這個酶的特性是逆轉錄至mRNA的5’末端后，會發揮末端轉移酶的活性，在cDNA的3’端額外合成一段不依賴模板的幾個堿基序列，并以逆轉錄體系中游離的特定堿基序列作為新的模板繼續合成cDNA，最終得到了一個兩端包含固定序列的全長的單鏈cDNA模板，隨后利用此cDNA作為模板進行大量擴增。
文庫構建流程
擴增得到的雙鏈cDNA經過Tn5轉座酶切打斷及加接頭， PCR擴增及磁珠純化等步驟，即得到所需測序文庫。構建好的文庫經Agilent片段分析儀和Q-PCR質控合格后可進入測序環節。
測序策略
表1 測序策略及數據推薦
測序讀長推薦 | PE100 |
測序平臺 | DNBSEQ平臺 |
測序數據量推薦 | 6G或以上 |
信息分析內容
單細胞轉錄組測序能反映基因的表達差異，有助于研究基因調控網絡和基因表達的異質性與隨機性，結合系統生物學的方法，能應用到腫瘤研究領域。單細胞水平的基因表達調控網絡分析，可監控疾病進程，持續追蹤腫瘤相關基因的動態表達，對單個細胞的轉錄組進行測序，還可以研究胚胎不同發育階段的組織器官圖譜。以下是我們基于不同的測序讀長（PE100、SE50），可進行的生物信息分析內容：
表2 標準信息分析內容
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信息分析條款 |
信息分析內容 |
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標準信息分析 （ref） |
1、基本數據統計① 去除接頭序列、低質量序列得到reads信息，②
樣品相關性，③ 表達量分布，④ RNA分類； 2、參考基因組比對； 3、mRNA鑒定； 4、mRNA定量分析； 5、mRNA差異表達分析（樣本間、組間）； 6、mRNA表達/差異基因聚類； 7、mRNA差異基因GO分類、富集； 8、mRNA差異基因KEGG分類、富集； 9、mRNA結構分析（SE50測序不包含此項）①
可變剪切分析，②融合基因分析（僅限人） |
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Dr.Tom信息分析（ref） |
一）數據庫注釋 1、轉錄因子注釋（AnimalTFDB/PlantTFDB）； 2、GSEA分析； 3、Rfam、Pfam、Reactome、COG、EggNOG和InterPro數據庫注釋； 二）互作網絡分析 1、靶基因分析① miRNA-mRNA靶向關系分析，② lncRNA-mRNA靶向關系分析； 2、ceRNA互作網絡分析； 3、蛋白互作網絡分析； 4、共表達互作網絡分析； 三）特色分析 1、自定義標簽和自有數據上傳； 2、外部數據庫信息（TCGA、ARCHS4）； 3、卡方檢驗； 4、關鍵驅動基因網絡圖分析； 5、時間序列分析 |
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定制化信息分析 |
可結合客戶的需求，協商確定定制化信息分析內容。 |
單細胞RNA-seq對感覺傳遞神經元進行精確細胞亞群區分
Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing
雜志： Nature Neuroscience
影響因子： 21.2
細胞類型：小鼠腰椎神經
研究背景：
感官系統是由多種多樣的細胞組成，它有很多復雜功能還沒有研究清楚。文章通過對622個鼠的神經元進行測序和轉錄組分析，進而通過它們的明顯的分子和功能的特異性對其分類：3種明顯的低閾值機械性刺激感受神經元，2種本體感受神經元，6種主要的熱敏神經元，痛感神經元，C型低閾值力量感受神經元，疼痛感受神經元。
文章不僅通過大規模的單細胞RNA測序，從分子水平驗證了這些不同的神經元細胞類型，并發現了一些新的細胞亞型和找到這些新的細胞亞型對應的marker。例如，文章發現了皮膚炎癥（例如過敏性皮炎）相關的疾病激發的疼痛感是明顯的聯系到特定的一種痛感神經元相關。
文章總結并發現了單細胞RNA-Seq的方法可以很好的分析和研究感官反應細胞與特定類型的神經元之間的對應關系，文章的結果說明了感官細胞的多樣性及其對體內感覺的復雜性等。
部分研究結果：
1. 文章對799個細胞表達量PCA聚類分析，鑒定離散的感覺神經元細胞群。鑒定結果顯示神經元細胞個數為622個，非神經元細胞個數109個，68個細胞沒有找到明確的定義。把這些細胞分成了五個類群，其中一個類群屬于非神經元，其余四個類群是神經元。在做進一步的細胞子分類PCA聚類分析時，找到了3個新的子分類細胞群：NF1,NF2/3,NF4/5。
圖1 細胞表達量PCA聚類圖
圖中每一個點為一個細胞，顏色反饋的是表達量的高低，根據表達譜的差異，把細胞聚成了5個類群
2. 通過GO分析，預測和區分了不同類型細胞各自對應的功能特征，同時也可以通過這些GO分析明顯看出不同的神經細胞的GO功能聚類。
圖2 GO功能聚類分析
3. 特異基因表達量進行功能和特征性的聚類分析，結果如圖5， Ntrk2、 Ret、Calb1和Ntrk3都在NF1-NF3中表達，鑒定為低閾值的機械敏感性受體細胞類型.同時文章還發現一小群的應答和調節炎癥導致的疼痛相關的細胞類型。
圖3 通過對不同類群神經元進行表達量熱圖分析，找到亞群特征性的基因
部分內容展示：
圖1 差異聚類熱圖
圖2 功能富集或分類圖
圖3 蛋白互作網絡
樣品要求
a)????? 真核生物，mRNA具有Poly(A)結構。
b)????? 單細胞：細胞直徑大于10μm，如卵母細胞、動物桑葚期至囊胚期單個細胞，細胞系分離的單細胞等。
c)????? 微量細胞：細胞數目在200個以下，如動物桑葚胚，囊胚。
d)????? 微量total RNA：一般要求RNA 28S/18S≥1，RIN≥7，濃度＞50pg/uL。
表1 單細胞RNA測序送樣要求
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測序類型 樣品類型 |
轉錄組、RNA-Seq |
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單細胞 |
1-2個（4μL裂解液） |
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微量細胞 |
2≤X≤200（4μL裂解液） |
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微量總RNA |
RNA 28S/18S≥1，RIN≥7，濃度＞50pg/uL |
注：表中X為細胞數目
