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單管單細胞重測序
單細胞研究概述
目前測序技術已經深入到人類疾病健康、物種進化、動植物分子育種等傳統的生物學研究領域中，逐漸成為一種不可或缺的研究工具。然而隨著生命科學和醫學基礎研究的深入發展，人們發現越來越多的特殊標本和特定的生物學現象，如法醫鑒定的微量標本、腫瘤內部異質性等無法用常規組織測序的方法進行研究。為了更好的處理這些標本和研究這類現象背后的機理，科學家經過不懈的努力，從而產生了單細胞擴增和分析技術。單細胞技術在人類疾病健康研究的應用將更好地揭示它們的發生發展過程和規律, 從而有助于人類疾病的認識、預防、診斷和治療。
研究流程
圖1 單細胞DNA技術研究流程圖
單細胞DNA擴增技術比較
MALBAC | MDA | |
擴增的DNA長度 | 0.5-1.5kbp | 2-100kbp |
人工序列引入 （Induced artificial sequence） | 70bp = 35bpx2 (作為引物 => ~7% 數據浪費) | 不存在 |
覆蓋度 (>25X時) | 84%~93% | >95% |
假陽性率 | 4X10-5 | 1X10-5 |
對于MDA和MALBAC兩種技術，我們檢測了低深度下的數據質量。如下是我們測試的結果：
|
單細胞1* (MDA) |
單細胞2* (MALBAC) |
|
|
比對率(%) |
92.81 |
88.45 |
|
全基因組覆蓋度(%) |
7.935 |
7.09 |
*樣品選擇：第一例亞洲人基因組供體（炎黃）的類淋巴母細胞細胞系的單細胞；
*數據設置：分別用MDA和MALBAC技術對兩個重復做0.1X深度的擴增;
從結果可以看出，低深度數據下，MDA的Mapping率和覆蓋度都優于MALBAC方法法。我們的MDA方法的數據有效性也略優于MALBAC（reads會截取35bp的數據浪費）方法。高深度的測序（MDA技術）非常適合SNV檢測。
文庫及測序策略
文庫構建策略： 根據研究目的構建人重、外顯子、目標區域文庫
測序策略：DNBSEQ平臺 PE150
推薦數據量：
針對大批量細胞的測序，可以進行低深度潛覆蓋測序；對于細胞之間親緣關系較大的，可以適量增加測序深度。
針對小規模細胞測序，研究功能性變化的，可參考常規全基因組重測序/外顯子組測序/目標區域測序的測序深度。
其余個性化研究目的，測序深度視不同的研究目的可適度調整。
信息分析內容(建議30X以上覆蓋深度)
- 去除接頭污染序列及低質量數據
- 比對，產出數據統計
- SNP檢測、注釋和統計
- InDel檢測、注釋和統計
- SV檢測、注釋和統計（僅全基因組測序）
單細胞測序發現一例結腸癌為雙克隆起源，不同克隆展現不同的突變特征
Discovery?of?biclonal?origin?and?a?novel?oncogene?SLC12A5?in?colon?cancer?by?single-cell?sequencing
案例描述：
? ? ? ?深圳華大基因研究院聯合香港中文大學合作、北京大學腫瘤醫院/研究所的研究人員，對一例T3N0M0結腸癌病人的63個腫瘤單細胞、4個正常單細胞樣本進行外顯子測序。單細胞群體遺傳學分析發現腫瘤細胞群體存在兩個克隆群體，不同克隆具有不同的突變特征。
部分研究成果：
? ? ? ?群體遺傳學分析發現該例腫瘤為雙克隆起源。其主要克隆群體發生了APC、TP53突變，次要克隆群體CDC27和PABPC1為主要突變，但APC和TP53未發生突變。
? ? ? ? 單細胞水平發現SLC12A5為高頻突變，但群體水平突變率極低。功能驗證發現SLC12A5可能對結腸癌具有致癌效應。
圖1 結腸癌單細胞不同克隆群體的driver event分析
? ? ? ? 對結腸癌單細胞及另外21例結腸癌的變異結果進行分層聚類，發現major clone (red)主要包含TP53和APC，而minor clone (blue)主要包含CDC27和PABPC1，normal cells (green)不含突變。
圖2? 突變圖譜及dirver genes預測
(A) major clone中體細胞突變。左側代表突變頻率，右側表示預測的driver genes Q-score; (B) 21例結腸癌的體細胞突變圖譜，尖峰高度代表突變頻率; (C) 結腸癌單細胞的突變圖譜。
圖1? 同義和非同義snp統計圖
圖2? 基因組和編碼區域InDels分布圖
圖3? 存在結構變異的read對
圖4? 變異在基因組上分布統計
圖5? 變異基因通路代謝圖
樣品要求
主要針對人和小鼠樣品。若為其他物種，需要客戶提供看家基因檢測引物。
樣品準備
1)??????? 將細胞分選至裝有3～5μL PBS緩沖液的200μL PCR管中，細胞數目不得超過1000個。不建議另外加入其他細胞保護劑，如有特殊情況，加入其他試劑或者經過其他處理,請在樣品信息單中備注。
2)??????? 細胞分離完成后，請于10分鐘內放入-80℃冰箱或者干冰保存。也可暫存于-20℃，但保存時間不得超過3小時。
3)??????? 每個細胞樣品建議送4管重復，以保證后續實驗成功率。例如：需測序某一細胞樣品數為5個，則建議送樣細胞樣品管數為20。
4)??????? 除提供細胞樣品外，還需要每批次提供一個陰性對照，即在PBS緩沖液中加入0.1~0.5 μL的1% PBS-BSA溶液（分選細胞時，細胞所處保存溶液）。
表1 單細胞DNA測序送樣要求
|
測序類型 樣品類型 |
WGS |
WES/目標區域測序 |
|
單細胞 |
1-2個（4μL
PBS懸液） |
1-2個（4μL
PBS懸液） |
|
微量細胞 |
2≤X≤1000（4μL
PBS懸液） |
2≤X≤1000（4μL
PBS懸液） |
注：X為細胞數目
?
Q1：單細胞重測序大致流程如何？
單細胞分離（口吸管法）→單細胞裂解提取DNA→單細胞全基因組擴增→建庫測序→信息分析。
Q2：單細胞分離方法有哪些？
單細胞分離主要有四種方法：激光顯微切割、流式細胞儀分選、微流控芯片分選和口吸管法分離。流式細胞儀需要對細胞進行染色和處理，可能影響全基因組擴增效果。目前華大采用的是口吸管法分離，該方法很大限度地避免了細胞損壞，還原細胞較真實的狀態。華大在單細胞分離擴增經驗非常豐富，現在已經完成了上萬個細胞的分離與擴增。
Q3：單細胞是由客戶還是華大分離？
推薦客戶送分離好的單細胞，并溶解在華大提供的裂解液當中。
Q4：單細胞腫瘤研究如何避免癌細胞取樣的假陽性？
華大對單細胞不經過任何染色，在顯微鏡下無法識別細胞是腫瘤細胞還是正常細胞，建議客戶取樣前通過病理學的方法估計腫瘤組織的純度，我們一般要求純度高于80%。雖然后期信息分析能排除腫瘤組織中正常細胞的干擾，但是腫瘤細胞含量較低需要選取的細胞總量將會增多，這會加大項目投入。
Q5：經過全基因組擴增之后可以得到多少基因組 DNA ？
全基因組擴增后可以得到3-5μg的DNA量，達到一般建庫測序的DNA量要求，可用于各種常規的重測序。
Q6：單細胞擴增實驗的成功率如何？
受樣品質量或細胞狀態的影響，可能造成全基因組擴增實驗失敗。根據實驗的經驗，現在我們的擴增成功率大概在50%，因此每例樣品實際擴增的細胞數量需為測序細胞數量的2倍以上，例如項目設計方案確定對該樣品的50個單細胞進行測序和分析，則至少需提供100個細胞。
Q7：華大對擴增產物質控指標如何？
全基因組擴增中擴增不均會導致測序覆蓋度低，為確保數據利用率，全基因組擴增實驗后須對擴增產物進行質控。我們通過PCR方法對管家基因進行檢測。檢測結果必須保證8個管家基因有6個以上陽性，反之則屬不合格樣品不能用于建庫測序。現階段管家基因質控的指標僅限于人，其他物種的還需要開發。此外我們還參考一般的DNA重測序送樣要求對擴增產物進行質控。
Q8：華大采用的全基因組擴增技術如何？
單細胞擴增主要有兩種類型的技術：基于熱循環以PCR為基礎的擴增技術,如簡并寡核苷酸引物PCR (Degenerate oligonucleotide primer PCR, DOP-PCR)、連接反應介導的PCR (ligation mediated PCR, LM-PCR)、擴增前引物延伸反應 (Primer extension preamplification, PEP)等；基于等溫反應不以PCR為基礎的擴增技術，如多重置換擴增 (Multiple displacement amplification, MDA)、基于引物酶的擴增 (Primase-based whole genome amplification, pWGA)。前者以DOP-PCR為代表，具有擴增均一性較高的優點，不足之處是擴增覆蓋度較低。后者以MDA為代表，該技術基于phi29酶在恒溫條件下進行擴增。該酶對于模板有很強的結合能力，能連續擴增10Kb 的DNA片段而不從模板上解離，同時這種酶具有3’→5’外切酶活性，錯誤率僅為5 x 10-6，大約比Taq DNA聚合酶低100倍，因此可以保證擴增的高保真性。華大單細胞全基因組擴增基于MDA技術，具有擴增產物長（大于10kb），覆蓋度高（一般不低于70%，可達90%以上），擴增錯誤率低（僅為10-6），具有高特異性和靈敏性的特點。
Q9：MDA擴增的特點如何？
MDA具有擴增產物長、覆蓋度高、擴增錯誤率低的優點，此外還存在兩個主要的不足：擴增均勻性和等位基因丟失。基因組上GC含量越高擴增效率越高，導致高GC含量的區域測序深度遠高于其他地方，呈現出明顯的擴增偏向性。除了存在擴增偏向性之外，在擴增過程中還存在等位基因丟失的問題（Allele dropout ,ADO，單細胞基因組上雜合的等位基因在擴增過程中會只擴增出其中一個等位基因，導致另外一個等位基因丟失的現象）。針對這些問題華大升級了擴增的方法，使得基因組上均一性比之前有了很大的提高；并且ADO也從之前Cell文章外顯子數據的平均43%降低到5%以下(小試數據)，大大降低了偏向性和ADO對下游信息分析的影響。（詳細信息請看新方法測評結果）。
Q10：單細胞DNA測序可以做哪些變異檢測？
單細胞經過全基因組擴增之后合格的擴增產物可以進行全基因組測序、外顯子測序、目標區域捕獲測序。不同的測序類型可以進行不同類型的變異檢測，外顯子測序和目標區域捕獲測序只能進行SNP和Indel的檢測；全基因組測序則能進行所有類型的變異檢測，如SNP、Indel、CNV、SV，全面地反饋單細胞水平上的所有變異類型。
