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單細胞全基因組甲基化測序
單細胞全基因組甲基化研究概述
DNA的甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下將甲基選擇性地添加到胞嘧啶上形成 5-胞嘧啶的過程，剛被發(fā)現(xiàn)時被定義為第5種堿基，實際上它是一種非常關鍵的表觀遺傳學標簽，對于調(diào)控和維持不同細胞類型的轉(zhuǎn)錄程序起到極其重要的作用。
同一個生物個體內(nèi)幾乎所有不同類型的細胞都擁有幾乎完全相同序列的基因組DNA，相同序列的 DNA 分子可以有大量不同的甲基化修飾狀態(tài)，正是這些甲基化修飾狀態(tài)的不同，使得每種類型的細胞，甚至是每個細胞都有自己特定的基因表達特點。這些不同的修飾以及修飾的組合，使得不同種類的細胞，或者同種細胞類型不同細胞間產(chǎn)生異質(zhì)性。這種單細胞水平的細胞類型特異的基因組甲基化修飾狀態(tài)，是表觀遺傳學領域的重要研究方向。
研究流程
技術優(yōu)勢
- 首先對細胞進行BS處理，再加接頭擴增，盡可能減少單細胞內(nèi)DNA甲基化修飾的損失。
- 在隨機引物擴增過程加接頭，減少操作步驟、降低DNA損耗。
信息分析內(nèi)容
1. 去接頭污染、低質(zhì)量的reads，并統(tǒng)計數(shù)據(jù)產(chǎn)出量及測序質(zhì)量；
2. 將Clean Data中的reads比對到ref基因組，并統(tǒng)計比對率、duplication rate、Insert Size分布及平均測序深度；
3. 全基因組C位點的甲基化信息計算，并統(tǒng)計BS轉(zhuǎn)化率及C位點的深度-覆蓋度；
4. CGI、promoter區(qū)域的C位點覆蓋度；
5. 甲基化水平的分布：
a) 多樣本時，各樣本全基因組上的整體平均甲基化率的分布；
b) 全基因組（n kb窗口）的甲基化水平的分布及圖形展示；
c) 各樣本中，幾類gene區(qū)域中，甲基化狀態(tài)分布的趨勢；
6. 甲基化/非甲基化 位點個數(shù)的統(tǒng)計，及它們在各gene元件上的個數(shù)分布；
7. 甲基化/非甲基化 區(qū)域的計算；
8. CGI的甲基化狀態(tài)的展示：
a) 甲基化的、非甲基化的、中間甲基化狀態(tài)的CGI的個數(shù)分布；
b) CGI平均甲基化率的分布；
9. 多樣本時，樣品聚類；
10. 多樣本時，同質(zhì)性/異質(zhì)性的分析；
a) CpG位點甲基化狀態(tài)的一致性計算；
b) CGI區(qū)域甲基化狀態(tài)的一致性計算；
c) 樣本間n kb窗口的甲基化水平的相關性；
11. Group間DMR區(qū)域的計算及注釋。
單細胞全基因組甲基化測序揭示鼠肝甲基化組的強烈異質(zhì)性
Single-cell genome-wide bisulfite sequencing uncovers extensive heterogeneity in the mouse liver methylome
研究概述：
通過對21個肝臟細胞和5個胚胎成纖維細胞進行全基因組甲基化測序，分析其全基因組5mC甲基化圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鼠肝臟細胞甲基化可變性非常高，并具有高度的異質(zhì)性；其中包含H3K4mel的區(qū)域可變性非常高，promoters和CpG islands非常穩(wěn)定。同時，文章發(fā)現(xiàn)不同基因組特點的5mC甲基化異質(zhì)性也有所差異；其中非功能位點，如重復序列、內(nèi)含子區(qū)域很不穩(wěn)定；潛在的功能區(qū)位點，如：promoters區(qū)域較為穩(wěn)定。
結(jié)果展示：
1. 單細胞全基因組甲基化的genome-wide 5mC分析結(jié)果展示：
2. 5mC 異質(zhì)性分析結(jié)果展示：
圖1 500bp窗口下的CpGs水平分析
圖2 所有樣本甲基化水平相關性分析
圖3 樣本聚類分析
圖4 甲基化CGIs重復性分析
圖5 gDMR組間甲基化差異程度分布
圖6 DMR相關基因的GO聚類分析
樣品要求：
裂解好的單細胞：細胞數(shù)目為實際數(shù)目的兩倍（如客戶計劃做 5 個細胞，應該至少送 10 個細胞）；
細胞培養(yǎng)物（細胞系、原代培養(yǎng)細胞等）：完整且有活性的細胞數(shù)量不少 2x105 個；
新鮮組織：組織尺寸不小于 1cm3 或者消化后細胞數(shù)目不少于 1x107 個（BGI 僅提供通用組織消化方法，不同組織消化條件略有不同，需要自行測試）。
血液：不少于 5 mL EDTA 抗凝血。
Q1：單細胞全基因組甲基化測序大致流程如何？
單細胞分離（口吸管法）→單細胞裂解→Bisulfite轉(zhuǎn)化→Index建庫&PCR→文庫質(zhì)檢→上機測序→信息分析→結(jié)果交付。
Q2：單細胞全基因組甲基化測序建議測多深的覆蓋度？
對單細胞樣品來說，建議測序深度4X-5X即可。實驗數(shù)據(jù)表明，單個細胞在clean data為3X數(shù)據(jù)量的情況下，其CpGs的覆蓋度為20%，并趨于飽和態(tài)。
Q3：單細胞全基因組甲基化的技術穩(wěn)定性及重復性如何？
測評數(shù)據(jù)表明，使用單細胞全基因組甲基化建庫方法進行建庫測序的多細胞（Bulk）樣品CpG位點一致性可達79.52%，說明該方法的穩(wěn)定性及重復性較好。
圖1 500bp窗口下的CpGs水平分析
Bulk為多細胞樣本，CpG位點的一致性為：79.52%。其中包含了4個樣本：Bulk1(5 μg)，Bulk2(50 ng)，Bulk3(50 pg)，Bulk4(15 pg)。
YHsc為單細胞樣本，單細胞文庫間的相關性較多細胞（Bulk）樣本差，分別為62.34%，說明單細胞間的異質(zhì)性是比較明顯的。
