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全轉錄組
全轉錄組高通量測序，采用去核糖體鏈特異性建庫方法和小片段富集篩選建庫方法，可實現編碼RNA和非編碼RNA的建庫、測序、信息分析及聯合分析、ceRNA等，從而快速全面準確地獲得與特定生物學過程（例如發育、疾病等）所有大RNA轉錄本數據信息，這一項研究將調控機制研究延伸到“ 網、多層面”結合的立體模式，有助于相對全面解讀生物學現象。
推薦方案
推薦兩種測序策略方案：
1） 經濟型模式-兩種文庫測序：LncRNA-Seq + Small RNA
大RNA研究：采用LncRNA-Seq測序模式，即采用去核糖體鏈特異性建庫模式，進行PE100測序模式，10G Clean data；實現lncRNA、mRNA、circRNA鑒定和定量、以及功能分析；
小RNA研究：采用富集小RNA片段建庫方法，進行有方向性的SE50測序模式，20M clean reads，實現miRNA、siRNA以及piRNA鑒定和定量，以及功能分析等；
2） 大容量模式-三種文庫測序：LncRNA-Seq+ Small RNA+ CircRNA
大RNA研究：采用LncRNA-Seq測序模式，即采用去核糖體鏈特異性建庫模式，進行PE100測序模式，10G Clean data；實現lncRNA、mRNA、鑒定和定量、以及功能分析；
環狀RNA研究：采用去除線性RNA，反向富集環狀RNA建庫方法，進行PE100測序模式，10G clean data，對環狀RNA高深度測序，實現對低豐度的環狀RNA鑒定和定量及功能分析；
小RNA研究：采用富集小RNA片段建庫方法，進行有方向性的SE50測序模式，20M clean reads，實現miRNA、siRNA以及piRNA鑒定和定量，以及功能分析等；
以上兩種模式，還可以實現大RNA和小RNA互作網絡分析，以及內源競爭性RNA鑒定和網絡分析。
生物分析思路圖
產品優勢
實驗嚴謹
建庫工藝穩定，技術重復性高，可接受多種類型樣本，total RNA最低起始量低至400ng；
分析全面
包含RNA互作模式，及ceRNA競爭網絡分析等，從平面調控研究延伸至立體調控研究；
數據交互
采用Dr.Tom多組學數據挖掘系統，10大數據庫注釋，多維度結果圖片展示，數據圖表循環挖掘；
質控嚴格
實驗操作及信息分析操作采用全方位及先進的質量管理體系標準。
產品應用
動植物生長發育的研究
抗逆、抗病蟲害調控機理的研究
細胞分化和發育的研究
腫瘤發生發展及轉移研究
案例一、lncRNAs 和 mRNA 的共表達網絡—基因拷貝數變異相關的非編碼 RNA 與先天性心臟病[1]
研究目的：研究基因拷貝數變異（CNVs）中的 lncRNAs（CNV-lncRNAs）是否促成與 CHD 相關的 CNVs 的病因尚待探索
研究樣本：從孕四周開始直到成年不同發育階段的組織，主要為心臟組織
研究技術：RNA-Seq、lncRNA-miRNA-mRNA 調控網絡分析
研究摘要：
本研究使用人類器官發育的轉錄組數據，構建了涉及與 CHD 相關 CNVs 中的 CNV-lncRNAs 和蛋白質編碼基因的共表達網絡，并展示了在 10 個非綜合征 CHD 相關 CNVs 中的CNV-lncRNAs 聚集在最顯著的心臟相關模塊中，并且與多個關鍵 CHD 基因高度相關地共表達。在 15q11.2 區域內的 HSALNG0104472 被確定為一個具有心臟偏向表達的樞紐 CNV-lncRNA，并已通過實驗驗證。研究結果表明，HSALNG0104472 應該是一個主要效應因子，負責通過調節心肌細胞分化來導致 15q11.2 缺失的心臟缺陷。我們的發現表明，CNV-lncRNAs 可能潛在地促成了最大比例 68.4%（13/19）的非綜合征 CHD 相關 CNVs 的病理。這些結果表明，解釋與 CHD 相關的 CNVs 的發病機制應考慮非編碼區域。
研究路線：
圖1 研究路線
部分結果展示：
圖2 火山圖顯示了每個聚類中差異表達最顯著的CHD基因和CNV-lncRNAs
案例二、biomarker及內源性競爭RNA調控研究——鑒定宮頸癌lncRNA和環狀RNA等biomarker及ceRNA分析[2]
研究目的：研究宮頸癌lncRNA和環狀RNA致病分子調控機制
研究樣本：選取3個病人（HPV16）的宮頸鱗癌組織和癌旁組織。三個生物學重復樣本混樣（患病 vs 正常）
樣本處理： 選取癌組織旁邊2cm的癌旁組織，切除后即加入RNA later保護劑中30分鐘，隨后放入液氮中冷藏。
研究技術： 經濟型模式-兩種文庫測序：
*去核糖體建庫測序方式-研究mRNA、lncRNA、環狀RNA；
*小片段建庫測序方法-研究miRNA；
研究結果：共鑒定到差異表達的19個lncRNA，99個環狀RNA，以及304個mRNA 非編碼RNA中鑒定到3個新lncRNA和44個新環狀RNA，并對這些差異RNA進行功能富集分析。另外，共表達分析和功能預測中，發現19個差異表達lncRNA在致癌和癌癥發展中具有重要作用，ceRNA網絡分析表達和非表達RNA的相互作用，研究每一個miRNA靶向作用的lncRNA和Mrna競爭關系。發現一些miRNA可以靶向未知的lncRNA，說明這些非編碼RNA可能與宮頸癌有關。
研究結論：此次研究結果表明，非編碼RNA將有可能作為宮頸鱗癌治療和診斷的biomarker。CeRNA網絡研究在未來宮頸鱗癌研究中將對編碼RNA和非編碼RNA的關系及重要作用研究的將是重要的分析工具。 
圖3 CeRNA網絡分析，包含lncRNA、miRNA和mRNA
（A）包含所有lncRNA/miRNA和miRNA/mRNA互作關系
(B) lncRNA-LNC_000188的ceRNA競爭網絡
(C)LNC_000231的ceRNA競爭網絡.
每個節點的大小與每個節點的計算功能連接性成比例
案例三、biomarker及內源性競爭RNA調控研究——鑒定宮頸癌lncRNA和環狀RNA等biomarker及ceRNA分析[3]
研究目的：研究非編碼RNA參與調控次級毛囊(SHFs)細胞凋亡發生的分子機制。
研究樣本：生物學重復樣本-三只羊，絨山羊毛發生長初期階段和中期階段（catagen vs. anagen）的皮膚，各三個重復。
研究技術： 經濟型模式-兩種文庫測序：
*去核糖體建庫測序方式-研究mRNA、lncRNA、環狀RNA；
*小片段建庫測序方法-研究miRNA；
研究結果：共鑒定到1122個已知和403個新lncRNA，其中173個lncRNA差異表達；另外鑒定到3500差異表達的Mrna表達轉錄本；411個已知miRNA和307個新miRNA，包含72個差異表達miRNA；進而對lncRNA的順勢和反試調控靶基因進行鑒定，發現，lncRNA和miRNA在毛囊發育過程之中具有重要的系統調控作用，比如生長中期誘導物因素(TGFβ1和BDNF)是由miRNA-873和lnc108635596 lncRNA-miRNA-Mrna調控網絡共同調控。
研究結論：闡明了在皮膚細胞凋亡和抗凋亡的分子相互作用，為毛囊退化提供深入的研究提供指導。
圖4 LncRNA–miRNA–mRNA 調控網絡圖
環形表示 miRNA、方形表示編碼基因、三角形表示 lncRNA. 紅色代表上調，綠色下調（初期/中期）
參考文獻：
[1] Lu Y, Fang Q, Qi M,et al. Copy number variation-associated lncRNAs may contribute to the etiologies of congenital heart disease. Commun Biol. 2023 Feb 17;6(1):189.
[2] Wang H, Zhao Y, Chen M and Cui J (2017) Identification of Novel Long Non-coding and Circular RNAs in Human Papillomavirus-Mediated Cervical Cancer.Front. Microbiol. 8:1720.
[3] Zhou G, Kang D, et al. Integrative analysis reveals ncRNA-mediated molecular regulatory network driving secondary hair follicle regression in cashmere goats. BMC Genomics. 2018 Mar 27;19(1):222.
圖1?差異表達基因和差異表達miRNA靶基因韋恩圖
Target 表示差異miRNA的靶基因，mRNA表示差異mRNA對應的基因
圖2 交集基因的表達量熱圖
圖3?差異表達miRNA和差異靶基因的調控網絡分析圖
圖4?差異表達lncRNA與靶基因的蛋白互作和共表達互作網絡圖
圖5?差異ceRNA—mRNA互作網絡圖
表1 全轉錄組測序樣品判定標準
|
總量 |
濃度 |
RIN |
純度 |
|
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Total RNA (Human / Rat)-經濟型 |
≥400ng |
≥20ng/μL |
RIN≥6.0 |
28S/18S≥1.0 無DNA，蛋白/鹽離子等污染，樣本無色透明不粘稠 |
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Total RNA (Human / Rat)-大容量型 |
≥2.4μg |
≥20ng/μL |
RIN≥6.0 |
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Total RNA（Plant/Animal）-經濟型 |
≥2 μg |
≥40 ng/μL |
RIN≥6.0 |
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Total RNA（Plant/Animal）-大容量型 |
≥4 μg |
≥40 ng/μL |
RIN≥6.0 |
Q1：全轉錄組產品兩種技術模式如何選擇？
全轉錄組有兩種模式，一種為經濟型，即采用兩種建庫測序模式；一種為大容量型，即采用三種建庫測序模式；主要區別在于環狀RNA研究方式不同，一個是對環狀RNA廣譜研究，即對環狀RNA表達情況初步研究； 二是對環狀RNA單獨富集建庫測序，即可實現對環狀RNA高深度研究，以及低表達環狀RNA的鑒定和定量分析等。所以如果選擇兩種模式，是需要根據研究目的和需求決定的，以及對RNA研究深度需求決定的。
Q2：全轉錄組送樣量要求？
需要根據選擇的研究模式決定，是滿足兩種建庫測序模式（LncRNA+Small RNA）總量需求：Total RNA最低起始量400ng ，還是滿足三種建庫測序模式（LncRNA+Small RNA+CircRNA）總量需求：Total RNA最低起始量2.4ug。
Q3：長鏈非編碼RNA建庫測序結果可以用于分析環狀RNA嗎？
可以，長鏈非編碼RNA建庫模式采用去核糖體方式建庫，對所獲得的RNA進行打斷測序，相當于獲得全部RNA，即可以進行分析環狀RNA表達情況，可應用于分析各物種環狀RNA表達譜。
Q4：LncRNA測序數據中mRNA的定量效果如何？
人標品：已知mRNA定量與qPCR定量斯皮爾曼系數達到0.88。
