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真核鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測序
轉(zhuǎn)錄組測序，對某一物種或特定細胞在某一功能狀態(tài)下產(chǎn)生的mRNA進行高通量測序，既可以提供定量分析，檢測基因表達水平差異，又可以提供結(jié)構(gòu)分析，能發(fā)現(xiàn)稀有轉(zhuǎn)錄本，精確地識別可變剪切位點、基因融合等，而且不依賴于參考基因組。
技術(shù)優(yōu)勢
1.鏈特異性文庫：能檢測反義鏈表達，比對率更高，定量更準確，注釋、可變剪切和基因融合等結(jié)果更可靠；
2.樣品起始量低：人鼠樣本起始量僅需200 ng；可微量定制化建庫，低至200 pg；可單細胞定制化建庫，低至單個細胞；
3.高質(zhì)量的自主測序平臺：DNBSEQ測序技術(shù)具有滾環(huán)復制擴增帶來的錯誤累積低和規(guī)則陣列載片帶來的信號密度高等原理性優(yōu)勢，大幅提高了測序的準確性；而且，基于DNBSEQ測序平臺的產(chǎn)出數(shù)據(jù)重復序列率低(Dup率低)、有效數(shù)據(jù)利用率高、標簽跳躍少（Index hopping少），能有效降低“張冠李戴”的情況。
4.Dr. Tom系統(tǒng)：無需生信分析基礎，多數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析，多維度數(shù)據(jù)展示，循環(huán)挖掘數(shù)據(jù)，輕松自主做個性化分析。
5.提供針對微量樣本以及降解樣本等多類型樣本的不同建庫技術(shù)方案，以滿足不同的科研需求。
產(chǎn)品應用
醫(yī)學上的應用方向——
農(nóng)學上的應用方向 ——
研究內(nèi)容
一、無參考序列物種
標準信息分析：
1. 測序數(shù)據(jù)過濾；
2. 轉(zhuǎn)錄組de novo組裝；
3. Unigene七大功能數(shù)據(jù)庫注釋；
4. Unigene的CDS預測；
5. Unigene的TF編碼能力預測；
6. Unigene的SSR檢測；
7. Unigene表達量計算；
8. 時間序列分析；
9. 差異表達基因檢測；
10. 差異表達基因聚類分析；
11. 差異表達基因GO功能分析；
12. 差異表達基因Pathway功能分析；
13. 差異基因蛋白互作分析；
14. 植物抗病基因預測（植物樣本）。
定制化信息分析：
1. 可結(jié)合客戶的需求，協(xié)商確定定制化信息分析內(nèi)容。
二、有參考序列物種
標準信息分析：
1. 基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計① 去除接頭序列、低質(zhì)量序列得到reads信息，② 樣品相關(guān)性，③ 表達量分布，④ RNA分類；
2. 參考基因組比對；
3. mRNA鑒定；
4. mRNA定量分析；
5. mRNA差異表達分析（樣本間、組間）；
6. mRNA表達/差異基因聚類；
7. mRNA差異基因GO分類、富集；
8. mRNA差異基因KEGG分類、富集；
9. mRNA結(jié)構(gòu)分析：可變剪切分析；
10. mRNA結(jié)構(gòu)分析：融合基因分析。
Dr.Tom信息分析：
一）數(shù)據(jù)庫注釋
1. 轉(zhuǎn)錄因子注釋（AnimalTFDB/PlantTFDB）；
2. GSEA分析；
3. Rfam、Pfam、Reactome、COG、EggNOG和InterPro數(shù)據(jù)庫注釋；
二）互作網(wǎng)絡分析
1. 靶基因分析① miRNA-mRNA靶向關(guān)系分析，② lncRNA-mRNA靶向關(guān)系分析；
2. ceRNA互作網(wǎng)絡分析；
3. 蛋白互作網(wǎng)絡分析；
4. 共表達互作網(wǎng)絡分析；
三）特色分析
1. 自定義標簽和自有數(shù)據(jù)上傳；
2. 外部數(shù)據(jù)庫信息（TCGA、ARCHS4）；
3. 關(guān)鍵驅(qū)動基因網(wǎng)絡圖分析；
4. 時間序列分析。
（*以上分析內(nèi)容為部分物種可做。）
定制化信息分析 ：
1. 可結(jié)合客戶的需求，協(xié)商確定定制化信息分析內(nèi)容
案例一 RAF樣蛋白激酶介導一種高度保守且快速的生長素反應
文章題目：RAF-like protein kinases mediate a deeply conserved, rapid auxin response
發(fā)表期刊：Cell
影響因子：45.5
發(fā)表時間：2024年1月
發(fā)表單位：瓦赫寧根大學、查理大學、奧地利科學技術(shù)研究所、京都大學、東京理科大學
案例描述：該研究團隊鑒定了一種對生長素快速全蛋白質(zhì)組磷酸化的反應。這種反應發(fā)生在5種陸地植物和藻類物種上，并集中于一組核心的共同靶點。該研究鑒定出了這種生長素觸發(fā)的跨物種磷酸化的中心介質(zhì)是纖維肉瘤（RAF) 樣蛋白激酶，遺傳分析該激酶與生長素觸發(fā)的蛋白質(zhì)磷酸化和快速細胞反應聯(lián)系起來，從而確定了綠色譜系中生長素快速反應的古老機制。
參考文獻：Kuhn A, Roosjen M, Mutte S, Dubey SM, Carrillo Carrasco VP, Boeren S, Monzer A, Koehorst J, Kohchi T, Nishihama R, Fendrych M, Sprakel J, Friml J, Weijers D. RAF-like protein kinases mediate a deeply conserved, rapid auxin response. Cell. 2024 Jan
案例二 全球最大規(guī)模結(jié)直腸癌多組學研究
文章題目：Prognostic genome and transcriptome signatures in colorectal cancers
發(fā)表期刊：Nature
影響因子：50.5
發(fā)表時間：2024年8月
發(fā)表單位：中國科學院杭州醫(yī)學研究所、瑞典烏普薩拉大學（Uppsala University）、華大生命科學研究院、華大基因智惠醫(yī)學研究院
文章簡述：該研究實現(xiàn)了迄今為止最大規(guī)模的結(jié)直腸癌基因組和轉(zhuǎn)錄組的綜合分析，并將分子層面的發(fā)現(xiàn)與高質(zhì)量的臨床數(shù)據(jù)相結(jié)合，從而識別關(guān)鍵預后因子，這使這項研究有別于其他絕大多數(shù)癌癥基因組學的研究。
研究結(jié)果：基于華大基因DNBSEQ測序平臺，對瑞典U-CAN隊列（Uppsala/Ume? Comprehensive Cancer Consortium）中的1,063例結(jié)直腸癌樣本進行全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序分析，鑒定得到了96個顯著突變基因，其中，有24個為新發(fā)現(xiàn)的潛在驅(qū)動基因，并發(fā)現(xiàn)與WNT、EGFR和TGF-β通路相關(guān)的驅(qū)動基因和結(jié)直腸癌生存顯著相關(guān)。利用突變時序分析，推導出9個與癌癥發(fā)生早期事件相關(guān)的驅(qū)動突變基因和更傾向于在癌癥發(fā)生后期階段出現(xiàn)的突變基因。
這些發(fā)現(xiàn)為結(jié)直腸癌的早期檢測和靶向治療提供了臨床研究策略，并揭示了與腫瘤后期侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要分子變化。整合基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分子分型能得到更精細準確的患者預后分層，這對優(yōu)化臨床腫瘤分型、指導結(jié)直腸癌精準治療具有重要意義，新構(gòu)建的表達譜精細分型將在未來指導結(jié)直腸癌個體化診療中發(fā)揮重要作用。
參考文獻：Nunes, L., Li, F., Wu, M. et al. Prognostic genome and transcriptome signatures in colorectal cancers. Nature (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07769-3
部分內(nèi)容展示：
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圖1? 差異聚類熱圖
圖2? 功能富集或分類圖
圖3??蛋白互作網(wǎng)絡
表1 真核轉(zhuǎn)錄組測序核酸樣品判定標準
真核轉(zhuǎn)錄組（默認鏈特異性，非鏈特異和鏈特異性送樣建議相同） | |||||||
樣本類型 | 總量 | 濃度 | 完整性 | 28S/18S | 基線和5S | 純度 | |
分析儀 檢測 | 電泳檢測 | ||||||
Total RNA (真菌) | 1 μg | 20-1,000 ng/μL | RIN≥6.0 | RNA條帶清晰無彌散或拖尾 | 28S/18S≥1.0 | 基線平整，5S峰正常 | 無 DNA， 蛋白/鹽離子等污染， 樣本無色透明， 不粘稠 |
Total RNA (植物) | 400 ng | 10-1,000 ng/μL | RIN≥6.0 | 28S/18S≥1.0 | |||
Total RNA (其他動物) | 400 ng | 10-1,000 ng/μL | RIN≥6.0 | 28S/18S≥1.0 | |||
Total RNA (非全血人鼠) | 200 ng | 5-1,000 ng/μL | RIN≥6.0 | 28S/18S≥1.0 | |||
Total RNA (人鼠細胞系) | 200 ng | 5-1,000 ng/μL | RIN≥7.0 | 28S/18S≥1.0 | |||
Total RNA (昆蟲) | 400 ng | 10-1,000 ng/μL | RIN≥6.0 | NA | |||
表2 真核轉(zhuǎn)錄組測序組織樣品判定標準
組織類型 | 真核轉(zhuǎn)錄組文庫 |
新鮮培養(yǎng)細胞 (細胞數(shù)) | ≥2×105 cells |
新鮮動物組織干重 | ≥25 mg |
新鮮植物組織干重 | 嫩葉、嫩莖≥50mg 根、果實、種子、花等≥100mg |
菌體（細胞數(shù)或干重） | ≥5×106 cells 或 ≥20 mg |
全血-哺乳動物 | ≥1 mL 全血分離的白細胞 或≥1 mL PAXgene? Blood RNA Tube 收集的全血 或≥0.3mL 全血＋3 倍體積 TRIzol裂解液 |
全血-非哺乳動物 | ≥0.1 mL 全血分離的白細胞 或≥0.1 mL 全血＋6倍體積 TRIzol 裂解液 |
FFPE | ≥5片， 未染色， 組織面積≥100 mm2， 切片厚度5~10 μm |
1、DNBSEQ滾環(huán)擴增技術(shù)的特點是什么？
答：滾環(huán)擴增技術(shù)RCA的模板始終是同段序列，擴增錯誤不會累積，與PCR指數(shù)擴增相比具有保真優(yōu)勢。
2、DNBSEQ下機數(shù)據(jù)格式是怎么樣的？
答：通用下機數(shù)據(jù)格式：（FASTQ）讓數(shù)據(jù)兼容性更好。
3、DNBSEQ平臺真核轉(zhuǎn)錄組推薦數(shù)據(jù)量？
答：推薦6Gb以上；
4、可否提供DNBSEQ轉(zhuǎn)錄組標準品測試數(shù)據(jù)供客戶測評？
答：可以，我們1個UHRR標準品，構(gòu)建了3個文庫，測序數(shù)據(jù)可在EBI網(wǎng)站（http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB19428）下載。
5、鏈特異性文庫與非鏈特異性文庫建庫主要區(qū)別是什么，鏈特異性文庫的優(yōu)勢是什么？
答：鏈特異性文庫的構(gòu)建與非鏈特異性文庫不同點在于：鏈特異性文庫在cDNA二鏈的合成步驟，使用dUTP代替dTTP；
鏈特異性文庫的優(yōu)勢是1）能檢測反義鏈表達2）更精確地定量重疊的轉(zhuǎn)錄本 3）增強轉(zhuǎn)錄本注釋的可信度4）提高比對率 5）檢測可變剪切轉(zhuǎn)錄本、基因融合和等位基因特異性表達可信度高[3-7]。
6、鏈特異性文庫與非鏈特異性文庫在樣品要求、推薦數(shù)據(jù)量和分析條款上有什么不同？
答：兩者在這三方面是一樣的。但是雖然分析條款是一樣的，基因組比對和基因表達定量分析的參數(shù)上略有不同。所以在信息分析前（包括de novo和resequencing），生信人員需要根據(jù)建庫方法（鏈特異性文庫/非鏈特異性文庫），來設置正確的分析參數(shù)；鏈特異文庫堿基會根據(jù)樣本實際ATCG含量，呈現(xiàn)不等分離，屬于正常結(jié)果。
