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DIA蛋白定量
DIA 蛋白定量分析，主要采用數據非依賴性采集模式（data independent acquisition，DIA），通過液質聯用技術（LC-MS/MS）對蛋白質酶解肽段進行質譜分析，結合傳統的數據依賴性采集模式（data dependent acquisition，DDA）構建的譜圖庫，可對蛋白質組進行鑒定、定量，獲得肽段、蛋白及所屬物種來源、蛋白表達量變化等信息。
蛋白定量 DIA 目前主要在三種質譜儀器平臺進行檢測，常規 orbitrap 類儀器，timsTOF 類儀器以及更高分辨率的 orbitrap Astral 儀器等。
產品優勢
- 國內唯一參與DIA測評及建立大隊列DIA標準的企業，華大具有高水平的DIA技術交付能力，從鑒定數、重現性、線性、動態范圍等方面看，已達到全球先進水平；具有極佳的軟硬件優勢和過硬的操作流程；
- 重復性、穩定性高達90%，是大隊列血液樣品蛋白質組研究首選技術；
- 針對富含臨床信息的FFPE樣品，提供低至1片的蛋白質組定量服務；
- 顛覆傳統，創新性引入相關性差異分析，通過多維信息整合，穩健算法直擊核心功能，精準鎖定關鍵機制；
- 采用Dr. Tom云平臺進行數據交付，便于開展零生信基礎的數據挖掘，以及同轉錄組的自主關聯分析；
- 提供經典的蛋白質組非靶向發現+靶向驗證一站式服務；以及蛋白質組+轉錄組、蛋白質組+代謝組、常規蛋白質組+磷酸化蛋白質組學等一系列多組學關聯分析服務；
- 提供配體-受體、激酶-底物及轉錄因子-靶蛋白等全方位分析，深入探索信號調控通路，更好地開展分子機制、生物標志物、疾病機理和藥物開發研究（人、小鼠）。
產品應用
- 精準醫療領域
癌癥研究：腫瘤組織個體差異大背景差異大，需要單個樣本采樣比較
個體醫療：大規模的數據采集，需要高穩定性和重現性的技術支撐
- 動植物微生物研究領域
環境適應性研究：多種環境不同水平的處理同時比較，需要高穩定性和重現性的技術支撐
模式生物機理研究：深入探究體內調控機理，實現不同組別差異蛋白比較
技術路線
信息分析內容
信息分析條款 | 信息分析內容 |
標準信息分析 | 1 標準信息分析內容 1.1 數據產出統計 1.2 數據質控（組內變異系數、主成分分析以及樣本定量相關性） 1.3 蛋白質鑒定和定量結果 1.4 蛋白質GO分析 1.5 蛋白質COG/KOG/eggNOG分析 1.6 蛋白質Pathway代謝通路分析 1.7 差異蛋白的GO富集分析 1.8 差異蛋白COG/KOG/eggNOG富集分析 1.9 差異蛋白的Pathway富集分析 1.10 重復性分析（僅針對設計了重復的實驗） 1.11多樣品間表達模式聚類（三個或三個以上樣品可提供） 1.12 時間序列分析 1.13 差異表達蛋白互作分析 1.14 差異表達蛋白亞細胞定位 1.15 蛋白信號調控分析（針對人和小鼠） 配體-受體調控分析，激酶-底物調控分析，轉錄因子-靶蛋白調控，蛋白信號調控分析 |
1、肺腺癌化療藥物療效生物標志物篩選
Identification?of?serum?biomarkers?to?predict?pemetrexed/platinum?chemotherapy?efficacy?for?advanced?lung?adenocarcinoma?patients?by?data-independent?acquisition?(DIA)?mass?spectrometry?analysis?with?parallel?reaction?monitoring?(PRM)?verification.?
Translational?lung?cancer?research.?2021
背景：
培美曲塞/鉑化療是肺腺癌患者的標準化療方案，但療效差異很大，尋找預測藥物療效的生物標志物至關重要。
實驗設計：
接受培美曲塞/鉑化療的晚期肺腺癌患者的血清樣本的DIA蛋白定量分析結合靶向蛋白質組學技術PRM驗證。
主要結果：
1）發現階段：選擇20例接受培美曲塞/鉑化療的晚期肺腺癌患者的血清樣本（其中12例療效較好、8例療效不佳），進行DIA蛋白定量分析，共發現23個顯著差異表達蛋白（DEPs）。?
2）驗證階段：采用靶向蛋白質組學技術PRM，對挑選的16個DEPs，分別在發現階段的20例血清樣本以及另外23例患者血清樣本（16例療效較好、6例療效不佳）中進行驗證。PRM的定量驗證與DIA的結果有很好的相關性。?
3）DIA發現+PRM驗證的模式，發現谷胱甘肽過氧化物酶3?(GPX3)可作為潛在的生物標志物，這些生物標志物的潛在生物學機制有待進一步研究。
圖1?GPX3的PRM驗證結果
?
2、鹽脅迫下玉米種子萌發的分子機制研究
Comprehensive?transcriptome?and?proteome?analyses?reveal?a?novel?sodium?chloride?responsive?gene?network?in?maize?seed?tissues?during?germination.?
Plant,?Cell?&?Environment.?2020
背景：
發芽是成熟種子的胚根穿透周圍的屏障發育成幼苗的過程，已知多種環境因素會對其產生影響，但高鹽環境如何影響玉米種子的發芽尚不清楚。
實驗設計：
玉米種子分為SE鹽處理胚胎組，SR鹽處理胚乳組，CE胚胎對照組和CR胚乳對照組；每組3例生物學重復。利用SWATH（DIA）蛋白定量、RNA-Seq、qRT-PCR（驗證）、靶向代謝組（檢測脫落酸ABA的含量）等技術進行研究。
主要結果：
1）發芽試驗表明，在200 mM NaCl處理下，離體胚能夠萌發，而完整的種子受到高度抑制；推測玉米胚乳可能參與了鹽信號對周圍組織（如胚胎）的感知和轉導，并表現出與擬南芥完全不同的反應。
2）鹽脅迫反應一般會涉及ABA，通過分析體內ABA的分布和數量發現，與對照組相比，NaCl處理下離體胚的ABA水平沒有增加，表明ABA水平的升高依賴于胚乳。
3）轉錄組和蛋白質組研究發現鹽處理的胚胎和胚乳之間轉錄后和翻譯后的變化存在顯著差異，揭示了種子萌發在轉錄、轉錄后和翻譯三個層面上的空間動態調控，進而提出了一種新的玉米種子鹽脅迫感知和信號轉導模型。
4）本研究采用的蛋白質組和轉錄組聯合分析方法可用于尋找特定發育過程或應激反應主調控因子的相關研究。
圖2?玉米種子鹽脅迫感知和信號轉導模型
1、蛋白鑒定和定量概況
表1 各樣本鑒定結果概覽
|
Name |
Peptide number |
Protein number |
|
N_1 |
73592 |
7123 |
|
N_2 |
83437 |
7720 |
|
…… |
…… |
…… |
表2 差異蛋白統計列表
|
Comparsion group |
Down-regulated |
Non-regulated |
Up-regulated |
|
T-VS-N |
381 |
8005 |
703 |
|
XR-VS-N |
242 |
8369 |
479 |
|
XR-VS-T |
137 |
9020 |
118 |
圖1 差異蛋白統計圖
以Fold change≥1.2和Q-Value＜0.05兩個條件作為顯著性差異蛋白的篩選標準，得到組間上下調蛋白統計（左圖）及火山圖（右圖）
2、質控
圖2 質控結果
CV分布圖（左圖）；主成分分析（PCA，中圖）；樣本相關性分析熱圖（右圖）
3、功能分析
圖3 功能分析結果
GO功能注釋（左圖）；pathway顯著富集氣泡圖（中圖）；差異蛋白互作關系網絡圖（右圖）
4、差異網絡分析
4、蛋白信息調控分析（針對人和小鼠）
圖4 部分分析結果示例
表1 組織類樣品送樣要求
樣品類型 | 送樣量 | 備注 |
新鮮動物組織干重 | ≥5mg | 富含雜質或蛋白質含量低的樣品量干重≥5g，如植物的根、木質部、韌皮部組織等 |
植物和蕈類真菌（如蘑菇、木耳）類 樣品量濕重 | ≥300mg | |
酵母、霉菌類真菌和細菌、噬菌體等微生物 | ≥50mg，或細胞數≥5×106 | |
新鮮培養細胞數(個) | ≥5×106（細胞沉淀體積約30μl~50μl左右） | |
客戶分離好的外泌體 | ≥300μL，約1011Particles/mL | |
血液類（去高峰度） | 血清、血漿≥100μl | 解凍后血細胞會破裂，蛋白溶出來會影響分析，因此一般不建議送全血 |
表2 蛋白類樣品送樣要求
|
樣本類型 |
送樣量 |
|
蛋白液 |
≥40μg，濃度≥0.5μg/μL |
Q1：蛋白定量DIA和傳統的非標記定量相比有何優勢？
A1：傳統的非標記定量一般需要通過分級的方法開展，耗時久、重復性差、數據結果可信度不高；蛋白定量DIA技術是新一代非標記定量技術，可通過更優的數據采集模式，在相同時間采集到更豐富的信息，壓縮周期的同時，大福度提高樣本間平行比較的重復性，數據結果可信度極高。
