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非靶向代謝組學(xué)
基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS），無(wú)偏向性、盡可能多地檢測(cè)細(xì)胞、組織、器官或體液等生物樣本內(nèi)所有的小分子代謝物，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比分析，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析篩選差異代謝物，對(duì)差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析，進(jìn)而尋找代謝物與生理病理變化的相對(duì)關(guān)系。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
1. 代謝物鑒定準(zhǔn)確度高
使用標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定，提供鑒定可信度分級(jí)注釋，鑒定總數(shù)4,000+
2. 超高分辨率質(zhì)譜平臺(tái)
使用QE系列譜儀進(jìn)行檢測(cè)，儀器分辨率高、質(zhì)量精度高、穩(wěn)定性好
3. 規(guī)范化平臺(tái)嚴(yán)格質(zhì)控
全流程標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）指導(dǎo)，同位素內(nèi)標(biāo)與QC雙重質(zhì)控
4. 大樣本項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)豐富
高通量自動(dòng)化樣本制備系統(tǒng)進(jìn)行代謝物提取，實(shí)時(shí)監(jiān)控儀器檢測(cè)過(guò)程
5.分析創(chuàng)新
創(chuàng)新性引入相關(guān)性差異分析，通過(guò)多維信息整合，穩(wěn)健算法直擊核心功能，精準(zhǔn)鎖定關(guān)鍵機(jī)制。
產(chǎn)品應(yīng)用
- 疾病診斷、發(fā)病機(jī)理及預(yù)后研究
- 微生物感染及發(fā)病機(jī)理研究
- 腸道菌群與疾病研究
- 機(jī)體發(fā)育調(diào)控研究
- 藥物作用機(jī)制及靶點(diǎn)研究
- 天然藥物研究與新藥篩選
技術(shù)路線
技術(shù)參數(shù)
1. 儀器平臺(tái)
LC-MS/MS：液相-Waters ACQUITY UPLC，質(zhì)譜-Thermo Q Exactive / Q Exactive HF/Q Exactive HF-X等Orbitrap系列質(zhì)譜儀
2. 分析軟件
Compound Discoverer（Thermo, USA），metaX (華大自主開(kāi)發(fā)的代謝組學(xué)分析軟件包)
3. 數(shù)據(jù)庫(kù)
華大代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)(BGI MDB, BGI Metabolome Database) ，包含保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜信息
mzCloud 在線標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫(kù)，包含一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜信息，化合物數(shù)量30,000+
其他數(shù)據(jù)庫(kù) HMDB、KEGG、LIPID MAPS等
項(xiàng)目周期
30-60個(gè)自然日
案例一：L-肉堿治療后敗血性休克1年存活患者和死亡患者之間代謝組差異[1]
研究背景：
敗血性休克具有40%的致死率，L-肉堿是治療敗血癥休克的候選治療藥物?；颊邔?duì)L-肉堿的反應(yīng)可能取決于其獨(dú)特的代謝特征，而這些特征在臨床表型中并不明顯。為更好地了解敗血癥患者的代謝變化與以患者為中心的預(yù)后之間的關(guān)系，對(duì)接受L-肉堿治療的患者血清樣本采用非靶向代謝組學(xué)的手段檢測(cè)。
技術(shù)路線：
圖1 研究技術(shù)路線
主要結(jié)論：
1. 對(duì)L-肉堿和安慰劑治療后的患者代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行熱圖分析發(fā)現(xiàn)L-肉堿治療后存活和死亡患者代謝組成具有明顯差異，且接受安慰劑治療的患者具有顯著異質(zhì)性。
圖2 不同處理組之間代謝物熱圖分析
2. 對(duì)接受L-肉堿治療的患者不同時(shí)間點(diǎn)（T0h、T24h、T48h）取樣分析，發(fā)現(xiàn)酰基肉堿的水平升高，但是整體代謝組并沒(méi)有發(fā)生劇烈擾動(dòng)。
3. 接受L-肉堿治療后的1年存活患者和死亡患者具有顯著的代謝表型差異，表明這些差異的代謝物可能是體內(nèi)代謝過(guò)程紊亂的副產(chǎn)物；包括纖維蛋白肽A、醛賴氨酸、組胺等幾種與血管炎癥相關(guān)的幾種代謝標(biāo)記物在死亡患者中顯著上調(diào)。這些代謝指標(biāo)的變化可以用做評(píng)估患者預(yù)后反應(yīng)差異。
案例二：代謝組學(xué)研究早期結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物[2]
研究背景：
本研究是對(duì)結(jié)直腸癌（CRC）診斷生物標(biāo)志物的研究，而流行病學(xué)研究表明代謝綜合征增加了患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，且癌癥的早期篩查能夠有效地增加患者5年生存率，代謝組學(xué)對(duì)研究系統(tǒng)生物學(xué)小分子生物標(biāo)志物有重要意義。本研究旨在為CRC的診斷確定可靠的血清生物標(biāo)志物。
研究?jī)?nèi)容：
樣本選擇：人血清樣本
隊(duì)列選擇：篩選隊(duì)列（360例）、驗(yàn)證隊(duì)列（1,594例）、驗(yàn)證隊(duì)列（900例）、預(yù)測(cè)隊(duì)列（1,528例）
研究方法：非靶向代謝組、靶向代謝組
技術(shù)路線：
圖1 技術(shù)路線圖
主要發(fā)現(xiàn)：
1. 篩選隊(duì)列：選擇360血清個(gè)樣本（120例健康人、120例代謝綜合征患者、120例結(jié)直腸癌患者）進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)代謝物篩選，通過(guò)兩兩比較組分析得到30個(gè)差異表達(dá)代謝物，通過(guò)通路注釋分析發(fā)現(xiàn)這些差異代謝物主要與苯丙氨酸代謝途徑、甘油磷脂代謝途徑、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成途徑相關(guān)。
圖2 差異代謝物聚類分析
2. 確認(rèn)隊(duì)列：采用1,594個(gè)獨(dú)立隊(duì)列（580例健康人、577例代謝綜合征患者、437例結(jié)腸癌患者）進(jìn)行驗(yàn)證，利用PCA和OPLS-DA分析得到7個(gè)代謝物可作為潛在的生物標(biāo)志物，通過(guò)與疾病表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析和二元邏輯回歸分析確定酪氨酸、谷氨酰胺-亮氨酸作為生物標(biāo)志物，能夠明確的區(qū)分健康人群和結(jié)直腸癌患者。
圖3 確認(rèn)隊(duì)列中篩選7種潛在生物標(biāo)志物
3. 驗(yàn)證隊(duì)列、疾病預(yù)測(cè)隊(duì)列：接著對(duì)酪氨酸、谷氨酰胺-亮氨酸這2個(gè)生物標(biāo)志物通過(guò)900個(gè)驗(yàn)證隊(duì)列，采用受試者特征曲線分析進(jìn)一步評(píng)估了這2個(gè)生物標(biāo)志物的準(zhǔn)確性；最后挑選1528個(gè)人群作為預(yù)測(cè)隊(duì)列，分別評(píng)估標(biāo)志物的診斷能力的可靠性。
圖4 驗(yàn)證隊(duì)列對(duì)2種生物標(biāo)志物驗(yàn)證
參考文獻(xiàn)
[1] Evans, Charles R., et al. "Untargeted metabolomics differentiates L-carnitine treated Septic shock 1-year survivors and nonsurvivors." Journal of proteome research 18.5 (2019): 2004-2011.
[2] Li, Jiankang, et al. "Tyrosine and Glutamine-Leucine Are Metabolic Markers of Early-Stage Colorectal Cancers." Gastroenterology 157.1 (2019): 257-259.
1. 數(shù)據(jù)預(yù)處理及質(zhì)控分析
使用Compound Discoverer軟件進(jìn)行LC-MS/MS數(shù)據(jù)處理，主要包括峰提取、峰對(duì)齊和代謝物鑒定等一系列分析。Compound Discoverer導(dǎo)出的數(shù)據(jù)通過(guò)metaX進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理、質(zhì)控分析和后續(xù)分析。數(shù)據(jù)質(zhì)控的內(nèi)容包括，QC樣本的BPC重疊圖、所有樣本的PCA分析、各組的CV分析。
圖1 數(shù)據(jù)質(zhì)控分析
2. 代謝物的檢測(cè)和鑒定情況
（1）代謝物檢測(cè)數(shù)和鑒定數(shù)統(tǒng)計(jì)
對(duì)數(shù)據(jù)預(yù)處理后的代謝物檢測(cè)數(shù)量和鑒定數(shù)量統(tǒng)計(jì)如下表。
表1 代謝物檢測(cè)數(shù)和鑒定數(shù)統(tǒng)計(jì)表
|
離子模式 |
代謝物檢測(cè)數(shù) |
代謝物鑒定數(shù) |
|
pos |
5,182 |
2,359 |
|
neg |
2,749 |
1,291 |
pos—正離子模式，neg—負(fù)離子模式。
（2）代謝物的分類注釋和功能注釋分析
圖2 代謝物的分類注釋和功能注釋統(tǒng)計(jì)圖
3. 差異代謝物的篩選
通過(guò)PCA分析觀察了解兩組樣本的差異情況。采用多變量分析PLS-DA模型前兩個(gè)主成分的VIP值，結(jié)合單變量分析差異變化倍數(shù)（Fold Change, FC）和T檢驗(yàn)（Student's t-test）的q-value值來(lái)篩選差異表達(dá)的代謝物。篩選條件: 1）VIP ≥ 1；2） Fold-Change ≥1.2 或者 ≤ 0.8333；3） q-value < 0.05，同時(shí)滿足這三個(gè)條件，即為差異代謝物。
圖3 差異代謝物的篩選
4. 差異代謝物分析
包括差異代謝物的聚類熱圖分析和差異代謝物的代謝通路富集分析。
圖4 差異代謝物的分析
1. 重復(fù)數(shù)要求
每組樣本的生物學(xué)重復(fù)次數(shù)要求如下，重復(fù)次數(shù)越多越好。
表1 生物學(xué)重復(fù)次數(shù)要求
|
樣本類型 |
重復(fù)次數(shù)要求 |
|
植物、微生物、細(xì)胞樣本 |
≥ 6個(gè) |
|
動(dòng)物樣本 |
≥
10個(gè) |
|
臨床樣本 |
≥ 30個(gè) |
2. 送樣量要求
表2 送樣量要求
樣本類型 | 建議送樣量/例 |
血清、血漿、尿液、血淋巴、腦脊液、房水 | ≥200 μL |
濾紙條、拭子 | ≥4條 |
外泌體（須是分離好的外泌體） | ≥500μL，約1011 Particles/mL |
精漿、羊水、前列腺液、瘤胃液、呼吸冷凝液、胃灌洗液、肺泡灌洗液、汗液、唾液、痰液、牛奶、細(xì)胞培養(yǎng)液、發(fā)酵液 | ≥500 μL |
動(dòng)物及臨床組織、糞便、腸道內(nèi)容物、微生物菌體、脊髓、軟骨 | ≥100 mg |
細(xì)胞 | 107 個(gè) （需每份樣本細(xì)胞數(shù)目保持一樣） |
酒曲、酒醅、大曲發(fā)酵物等 | ≥500mg |
土壤、淤泥、海水沉積物 | ≥500mg |
Q1：“非靶向代謝組學(xué)”的代謝物鑒定數(shù)量是多少？
A1：代謝物鑒定數(shù)一般可以達(dá)到4,000+，鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度和數(shù)量在行業(yè)內(nèi)屬于領(lǐng)先水平。代謝物鑒定數(shù)的多少也與樣本本身的含有的代謝物數(shù)量多少有關(guān)，不同物種、不同組織器官樣本代謝物種類含量不同；如果樣本中的代謝物數(shù)量本身就比較少，那么檢測(cè)和鑒定到的代謝物數(shù)量也可能會(huì)少一些，以具體項(xiàng)目的檢測(cè)鑒定情況為準(zhǔn)。
Q2：同一代謝物在不同處理組是可以相互比較的，那么同一個(gè)個(gè)體，鑒定到的不同代謝物之間離子強(qiáng)度是否也可以進(jìn)行相對(duì)定量的比較？或者需要一個(gè)內(nèi)參？
A2：不同代謝物一般不可進(jìn)行相對(duì)定量比較。由于不同的代謝物響應(yīng)不同，它們之間往往是不可比的。比如，代謝物A與B在樣本中的濃度相同，但代謝物A的響應(yīng)率為代謝物B的100倍，那么質(zhì)譜檢測(cè)的代謝物A的響應(yīng)比B高，但并不代表A的濃度比B高。由于一個(gè)代謝物的響應(yīng)率一般是不變的，因此一個(gè)代謝物在不同樣本中的響應(yīng)是與其在樣本中的濃度成正相關(guān)的。不同樣本中相同代謝物是可比的。
