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免疫組庫測序
??????? T/B細胞是適應性免疫系統的兩大細胞群，細胞表面受體TCR/BCR存在一塊區域叫互補決定區（Complementary Determining Region, CDR），包含CDR1、CDR2、CDR3，其中CDR3最高變，在抗原識別中起關鍵作用。華大的免疫組庫測序是通過多重PCR和高通量測序技術，分析編碼CDR3區的DNA/RNA序列，獲得機體的免疫特征。
圖1 免疫組庫圖解
產品優勢
一站式服務：提供從CDR3的擴增、建庫、測序、后續信息分析以及數據挖掘一系列全方位的服務；
有針對性的研究方法：針對CDR3的V區及J區兩端設計引物，目的擴增CDR3區域；
擴增偏好性低：采用兩步法建庫，并優化引物配比，將擴增偏好性降低約70%；
可重復性高：同一樣本建庫兩次克隆一致性高；
圖2? 同一樣本實驗重復性評估(Hiseq)
更豐富的分析結果：新增多種結果統計圖表；新增V/J基因頻率分布統計、多樣品聚類分析、共性分析、差異分析；新增四種多樣性評估指標；
更友好的xbio結題報告展現形式：全新升級的結題報告界面友好，對分析方法及結果解釋詳盡，圖表按照發表文章要求展示，讓您一目了然；
更真實的克隆定量信息：將低質量reads與高質量克隆進行比對，挽回重要數據，讓克隆定量信息不丟失；
更強的糾錯能力和錯配處理能力：利用多層聚類方法，糾正PCR和測序引入的錯誤；錯配處理能力提升，更適合分析BCR的高突變區域。
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?產品應用
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服務內容
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目的鏈 |
目標區域 |
樣品類型 |
擴增方法 |
測序策略 |
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TCRα 或 TCRβ |
CDR3 |
DNA 或 RNA |
M-PCR (VJ) |
PE150 |
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BCRH 或 BCRL |
CDR3 |
DNA 或 RNA |
M-PCR (VJ) |
PE150 |
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BCRH (鑒定抗體亞型) |
CDR3 |
RNA |
M-PCR (VC) |
PE150 |
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信息分析內容
1、基本數據統計?
???? 數據過濾，對原始數據進行去除接頭污染及低質量reads的處理
???? 數據搭建，數據拼接，消除測序背景及有效數據構建
???? 數據統計，數據產出統計及測序數據的成分和質量評估
2、數據比對分析
? ???比對分析，與數據庫V/D/J基因片段比對
???? 比對結果統計
3、克隆序列特征注釋
??? CDR3區核酸序列和氨基酸序列
??? 鑒定無效序列（包含終止密碼子，超出結構范圍）
??? 鑒定單堿基突變（替換、刪除、插入）（for BCR）
4、單樣品克隆群體特征分析
?? ?CDR3序列長度分布
??? V/J基因頻率分布
??? V-J基因組合頻率分布（3D, Circos）
?? 克隆群體結構分析（頻率分布，D50曲線，甜甜圈圖）
5、樣品間比較分析?
??? 測序飽和度分析
??? 克隆多樣性分析(辛普森系數、香農威納系數等)
??? 樣品間共有克隆分析
??? 聚類分析（層次聚類，MDS聚類）
??? 組間差異分析
腫瘤案例： TCR克隆異質性與新抗原異質性及肺癌復發的關系
Cancer Discovery. 2017 Oct;7(10):1088-1097.
研究目的：尋找免疫檢查點（PD-1、CTLA-4）治療療效的biomarker
研究樣本：11例未轉移肺腺癌，共45 tumor regions (2 to 5 regions per tumor)
研究技術：WES、TCR sequencing
研究結果：病灶特有突變導致新抗原（neoantigen）的內部表達差異，因此，產生不同的免疫原性，形成了TIL克隆內部差異（TCR ITH）。TCR ITH（intratumor heterogeneity）高與術后疾病復發和低生存率有關。?
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圖1 TCR克隆異質性（ITH）與肺腺癌基因組和臨床的相關性
（A）年齡與MOI相關性；（B）新抗原與MOI負相關；（C）復發的病人具有更高的TCR ITH（lower MOI）；（D）MOI越高（TCR克隆多樣性越低），病人的無病生存期（disease-free survival）越長。MOI：克隆重疊指數，范圍0-1，0代表克隆完全不同，1代表克隆完全相同。
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感染類疾病案例：TCRβ序列特征可準確預測CMV感染狀態
Nature Genetics. 2017, 49(5): 659-665.
研究目的：確定是否可以用TCR特征預測CMV（巨細胞病毒）感染狀態。
研究樣本：群體1：共計666個樣本，其中289個CMV陽性，352個CMV陰性，40個感染狀態未知；群體2：120個驗證樣本。
研究結果：對289個CMV+和352個CMV-樣本進行免疫組庫測序，發現了CMV相關的TCRβ序列特征，并且利用TCRβ可以從666個研究樣本和120個驗證樣本中，準確鑒定出CMV感染狀態。研究還發現該群體的TCRβ與HLA-A或HLA-B顯著相關。
圖2 TCRβ可預測CMV感染狀態
（a）CMV+和CMV-樣本中unique TCRβ分布散點圖。（b）ROC曲線顯示TCRβ作為CMV感染狀態分類器的分類效果。其中虛線表示在群體1中的測試結果，短虛線代表群體1中的交叉驗證效果，實線代表群體2中獨立驗證效果。每條線上的黑圈代表最大后驗概率（MAP）的決定閾值。插入圖表展示的是群體2中MAP分類效果，敏感度為0.90，特異性為0.89。
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自身免疫性疾病案例：殺傷T細胞的突變積累可能與類風濕性關節炎發病有關
Nature Communications. 2017, 8:15869.
研究目的：大顆粒淋巴細胞白血病（LGL）常合并發生類風濕性關節炎（RA），研究發現LGL病人的CD8+ T細胞克隆存在STAT3突變，而擁有該突變的LGL病人更容易并發RA（43% vs. 6%）。因此推測，發生體細胞突變的CD8+ T細胞可能與RA發病有關。
研究樣本：82例新診斷未治療的RA病人，20例健康人，取外周血。
研究結果：首次采用CD4+ T細胞做對照，過濾生殖系突變（germline mutations），對分選的T細胞進行目標區域測序、外顯子測序和TCR β鏈CDR3測序。發現，大約20%（5/25）病人的CD8+ T細胞有體細胞突變（somatic mutations），而CD4+ T細胞沒有，RNA-seq確認了突變基因在CD8+ T細胞中高表達。功能分析發現，這些基因突變與免疫調控、細胞增殖有關，因此推測，發生體細胞突變的CD8+ T細胞可能與RA及其他自身免疫性疾病的發病有關。
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圖3 病人1中CD8+ T細胞的克隆分布及突變
（a）利用TCR測序獲得的CD8+ T細胞克隆分布。（b）病人1中存在兩個高頻克隆，經過免疫抑制治療后仍高表達。（c）利用擴增子測序，在流式分選后的亞群中進行突變驗證。（d）本文研究思路圖。
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華大基因已發表IR-seq相關文章
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研究內容 |
發表時間 |
發表期刊 |
影響因子 |
文獻標題 |
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肝癌亞型差異分析 |
2015.04 |
Oncoimmunology |
7.72 |
Identification of characteristic TRB V usage in
HBVassociated HCC by using differential expression profiling analysis |
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分析軟件 |
2015.08 |
Genetics |
4.56 |
IMonitor: a robust pipeline for TCR and BCR repertoire
analysis |
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駱駝 |
2016.09 |
PLoS One |
2.81 |
Comparative Analysis of Immune Repertoires between
Bactrian Camel's Conventional and Heavy-Chain Antibodies |
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實驗方法學 |
2016.03 |
PLoS One |
2.81 |
Systematic Comparative Evaluation of Methods for
Investigating the TCRβ Repertoire. |
|
肝癌 |
2015.07 |
Cancer Letters |
6.38 |
Immune repertoire: A potential biomarker and
therapeutic for hepatocellular carcinoma |
|
原發性膽汁性膽管炎 |
2016.09 |
Journal of immunology |
4.86 |
Clonal Characteristics of Circulating B Lymphocyte
Repertoire in Primary Biliary Cholangitis |
|
微小殘留病 |
2016.10 |
Frontiers in Immunology |
6.43 |
Minimal Residual Disease Detection and Evolved IGH
Clones Analysis in Acute B Lymphoblastic Leukemia Using IGH Deep Sequencing |
|
預測V/J基因軟件 |
2016.11 |
Frontiers in Immunology |
6.43 |
IMPre: An Accurate and Efficient Software for
Prediction of T- and B-Cell Receptor Germline Genes and Alleles from
Rearranged Repertoire Data |
|
乳腺癌、癌旁和淋巴結的TCR分析 |
2017.02 |
Cancer Immunology Research |
8.28 |
The Different T-cell Receptor Repertoires in Breast
Cancer Tumors, Draining Lymph Nodes, and Adjacent Tissues |
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結腸腺瘤和結腸癌浸潤淋巴細胞 |
2017.05 |
Journal of immunology |
4.86 |
Characterization of the B Cell Receptor Repertoire in
the Intestinal Mucosa and of Tumor-Infiltrating Lymphocytes in Colorectal
Adenoma and Carcinoma |
|
免疫缺陷 |
2015.12 |
Human Molecular Genetics |
5.99 |
DCLRE1C (ARTEMIS) mutations causing phenotypes ranging
from atypical severe combined immunodeficiency to mere antibody deficiency |
|
腎移植 |
2016.11 |
Transplant Immunology |
1.32 |
T cell repertoire following kidney transplantation revealed by high-throughput sequencing |
圖1 克隆群體特征分析
A，V-J基因組合頻率Circos圖，每個顏色塊代表一種基因，顏色塊越寬，頻率越高。色塊間的連線代表一種V-J基因組合方式。B，克隆頻率分布，橫縱坐標分別為克隆數和克隆頻率。C，克隆頻率分布甜甜圈圖。第一層為1個reads、2個reads及≥3 reads支持的克隆類型比例；第二層為≥3 reads支持的克隆類型中，top 20%、20%-40%、40%-60%、60%-80%、80%-100%克隆的累積頻率分布；第三層為top5克隆類型的頻率分布及對應的氨基酸序列。D，Top20 V基因頻率組間分布柱狀圖。
表1 免疫組庫DNA/RNA送樣建議
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樣本類型 |
總量 |
濃度 |
RIN |
28S/18S |
基線和5S |
純度 |
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Sorted
T cells RNA / PBMCs RNA |
≥500ng |
≥35ng/μL |
RIN≥7.0 |
28S/18S≥1.0 |
基線平整，5S峰正常 |
無DNA，蛋白/鹽離子等污染，樣本無色透明不粘稠 |
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Whole
blood RNA/ Tissue RNA |
≥1μg |
≥70ng/μL |
RIN≥7.0 |
28S/18S≥1.0 |
表2 免疫組庫組織送樣建議
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組織類型 |
提取DNA建議送樣量 |
提取RNA建議送樣量 |
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分選細胞 |
≥1×106 |
≥2×105 |
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新鮮動物組織干重 |
≥200mg |
≥30mg |
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全血 |
≥2mL |
≥ 1 mL全血收集的淋巴細胞or ≥ 1 mL Paxgene Blood RNA tube / RNAprotect? Animal Blood Tubes收集的全血 |
注意：對于組織樣品，若淋巴細胞含量低，存在擴增不出來的狀況。
Q1： TCR和BCR各條鏈編碼基因的區別？推薦哪條鏈？
TCR Beta鏈和BCR重鏈是由V、D、J基因編碼的，而TCR alpha鏈和BCR輕鏈是由V、J基因編碼的。從發表文章來看，研究TCR beta鏈和BCR重鏈的比較多。
Q2：免疫組庫測序可以區分IgG、IgM、IgD、IgE嗎？
免疫球蛋白的亞型，通過C區序列可以區分，華大有相應的引物，但必須是RNA樣品。利用多重PCR的方法，利用V區-C區的引物，用約30bp的序列區分。產物長度大約是在200-300bp。
Q3：免疫組庫的測序深度？能得到多少序列？
分析數據顯示，數據量的增加，主要影響低頻克隆，并且這些克隆的排序在一千多到九千不等，而研究往往只關注top100的克隆和疾病的關系，所以推薦起始數據量1G raw data。但如果客戶想關注更多低頻克隆，可以加大測序數據量。
Q4：做免疫組庫測序，用基因組DNA做模板好，還是RNA好？
DNA水平側重于研究基因重組信息，RNA水平側重于研究基因的表達狀態。使用DNA和RNA做模板各有優缺點:
gDNA的優點是：
1）因為每個基因只有兩個拷貝，因此可準確地反映免疫細胞受體的克隆數；
2）DNA更穩定，易儲存。
缺點是：
1）由于copy數不高，模板含量低，因此可能需要更多的樣品；
2）由于J區和C區之間有很大的intron區，受測序長度的局限，缺少特異性擴增引物來擴增CDR全長。
RNA的優點是：
1）J區和C區之間無intron，可用C區進行引物設計，擴增全長CDR；
2）由于表達豐富，模板含量高，樣品消耗量少。
缺點是：
1）免疫細胞受體的克隆性受到mRNA表達高低的影響，不能客觀地反應本身的克隆數；
2）RNA不如DNA穩定，樣品保存和操作要求較高。
